[发明专利]一种Sf9细胞的无血清全悬浮驯化方法

说明书

本发明属于生物领域，公开了一种Sf9细胞的无血清全悬浮驯化方法，包括如下步骤：步骤1：将Sf9细胞在添加硫酸葡聚糖的Sf‑900 III SFM培养基中重悬并将Sf9细胞稀释至0.6‑1.0×10⁶cells/mL；步骤2：添加热灭活胎牛血清至步骤1中，对Sf9细胞进行培养；步骤3：当步骤2中Sf9细胞密度在第三天达到4×10⁶cells/mL以上，重复步骤1和2；其中，每重复一次步骤1和步骤2，添加的热灭活胎牛血清的量逐步降低直至不添加热灭活胎牛血清依然可以使Sf9细胞密度达到4×10⁶cells/mL以上；步骤1中的Sf‑900 III SFM培养基中硫酸葡聚糖的终浓度为20‑30mg/L。该方法具有驯化次数少、驯化后细胞增殖后浓度高、活率高的优点。

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及一种Sf9细胞的无血清全悬浮驯化方法。

背景技术

目前成熟的细胞培养方式主要是单层静置贴壁培养、吸附法培养两种。单层静置贴壁培养指细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。优点是容易且廉价培养，在倒置显微镜下易于观察感染过程并且所有的细胞都可用这种方法维持培养。缺点是传代时活率较低，而且单层细胞限制了每毫升细胞密度，影响蛋白产量。吸附法培养，是固定化培养法的一种，该法是将细胞贴附于葡聚糖类微载体，细胞利用微载体的表面进行贴壁生长的培养方式。相比于静置培养方式，微载体悬浮培养有很大的优势，比如：提供较大的比表面积；易于观察与控制；容易实现细胞与培养液的分离，便于灌注培养；节省空间；具有较好的气液传质特性。缺点是细胞难以消化传代；微载体悬浮放大过程中，放大比例较小；微载体价格昂贵；回收微载体的过程复杂。

全悬浮无血清培养，相对于传统的微载体悬浮培养和培养基需要添加血清的培养方式，细胞用于病毒疫苗的制备无需微载体，从而可以突破细胞生长需要基质表面贴附的限制，还可以节约设备空间，提高设备利用率，真正意义上实现大规模培养；并且采用全悬浮无血清培养病毒制备疫苗，无需血清和消化液，从而可大大减少产品杂质的引入，简化后期的产品分离纯化过程，有效的降低了成本。因此利用全悬浮无血清的方式培养细胞具有明显的优势。

本申请人所述集团公司的另一子公司广东温氏大华农生物科技有限公司于2015年提出了一项发明专利ZL201510323791.6,公开了一种适用于无血清培养系统的vero细胞驯化方法，将冻存的vero细胞复苏后，置于有血清培养基中培养，并采用逐步降低血清含量的驯化方法驯化vero细胞。采用逐渐减少血清含量的培养方法对vero细胞进行驯化培养，以使vero细胞能适应无血清培养的环境，得到一种能适应无血清培养的vero细胞；驯化后的vero能在VP-SFM中连续传代培养至少50代。

经过研究发现，对于不同的细胞，需要采用不同的培养基，且很多时候单一的采用适用于该细胞的普通培养基可能无法达到最优效果。

采用逐步降低血清的方法能够适用于很多悬浮无血清细胞培养驯化过程，但是培养基的选择会对驯化过程、驯化后细胞的活性有明显的影响。

所以本案的研究重点在于：研究适用于Sf9细胞的最优的培养基和驯化方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种Sf9细胞的无血清全悬浮驯化方法，该方法具有驯化次数少、驯化后细胞增殖后浓度高、活率高的优点。

本发明的具体方案如下：一种Sf9细胞的无血清全悬浮驯化方法，包括如下步骤：

步骤1：将Sf9细胞在添加硫酸葡聚糖的Sf-900 III SFM培养基中重悬并将Sf9细胞稀释至0.6-1.0×10⁶cells/mL；

步骤2：添加热灭活胎牛血清(FBS)至步骤1中，对Sf9细胞进行培养；

步骤3：当步骤2中Sf9细胞密度在第三天达到4×10⁶cells/mL以上，重复步骤1和2；