[发明专利]一种L-天冬氨酸α-脱羧酶基因突变库的高通量筛选方法

说明书

本发明公开了一种L‑天冬氨酸α‑脱羧酶基因突变库的高通量筛选方法，包括以下步骤：制备L‑天冬氨酸α‑脱羧酶基因突变库孔板；向L‑天冬氨酸α‑脱羧酶基因突变库孔板中加入破碎液，充分震荡，离心，取上清加入到深孔板中，并加入天冬氨酸溶液，摇床反应；取反应后的深孔板，先用乙腈灭活，离心，再取上清液到酶标检测板；然后向所述酶标检测板中加入pH指示剂，并放入酶标仪，在560nm～600nm波长下读取OD值，最后筛选出较高OD值对应的L‑天冬氨酸α‑脱羧酶。该高通量筛选方法操作简便，实施准确，筛选速度快、效率高，而且成本较低；因此，特别适用于筛选出更多高活性的L‑天冬氨酸α‑脱羧酶，因此也有利于酶科学技术的推广应用。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种L-天冬氨酸α-脱羧酶基因突变库的高通量筛选方法。

背景技术

β-丙氨酸(B-alanine)，即3-氨基丙酸(3-aminopropanoic acid)，又称为β-氨基丙酸，β-丝析氨酸，β-初油氨基酸，其化学索引号(CAS)为107-95-9，分子式为C₃H₇NO₂。目前国内外生产β-丙氨酸主要采用化学合成法合成，根据初始原料的不同可以分为丙烯腈法、丙烯酸法、琥珀酰亚胺(丁二酰亚胺)降解法、β-氨基丙腈法、生物法等等。

L-天冬氨酸α-脱羧酶又称L-天冬氨酸l-脱羧酶，其能催化脱去L-天门冬氨酸的α羧基，生成β-丙氨酸，其反应式如下所示：

众所周知，L-天冬氨酸α-脱羧酶的酶活测定方法是研究该酶的基础，目前正在不断建立和改进。现已有的L-天冬氨酸α-脱羧酶活性测定方法有以下几种：

①测定¹⁴CO₂含量，L-天冬氨酸α-脱羧酶将L-[1-¹⁴C]-天门冬氨酸转化成β-丙氨酸，释放出¹⁴CO₂，收集¹⁴CO₂，通过电闪仪测定¹⁴CO₂含量。

②测定β-[1-¹⁴C]-丙氨酸含量，L-天冬氨酸α-脱羧酶将L-[4-¹⁴C]-天门冬氨酸转化成β-[1-¹⁴C]-丙氨酸，转化一定时间后经离心、洗涤等处理，进行纸层析网或硅胶薄板层析，然后用放射自显影测定β-丙氨酸含量。另外可以用离子交换的方法纯化¹⁴C-标记β-丙氨酸，再用放射自显影测定β-丙氨酸含量。该法灵敏度高，但放射性物质的使用具有一定危险性，普通实验室也不具备该条件。

③柱前衍生高效液相色谱法，2，4-二硝基氟苯柱前衍生高效液相色谱法为直接检测β-丙氨酸与L-天冬氨酸的新方法。该已知方法色谱条件包括：色谱柱为Zorbax SB C18柱(5μm，4.6*250mm)；流动相A为0.02mol/LNaAc-HAc缓冲液，pH6.2，流动相B为乙腈，采用线性梯度洗脱：时间(min)0-20，流动相B(体积百分含量)5-33％；流速为1.0mL/min；柱温为30℃；检测器为紫外可见光检测器，检测波长为360nm，参比波长为600nm：进样量为20μL。然而，该方法操作复杂，衍生配方组分多，衍生剂用量大，实施成本高，分析时间过长，因此并不适用于高通量的筛选。

发明内容

由于现有技术并不适用于以高通量的方式筛选出高活性的L-天冬氨酸α-脱羧酶，本发明致力于提供一种脱羧酶基因突变库的高通量筛选方法，其能快速筛选出活性较高的L-天冬氨酸α-脱羧酶。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括：

一种L-天冬氨酸α-脱羧酶基因突变库的高通量筛选方法，其包括以下步骤：

S1：制备L-天冬氨酸α-脱羧酶基因突变库孔板；