[发明专利]一种体外培养HEK293细胞用于瞬时表达蛋白的方法

权利要求书

1.一种体外培养HEK293细胞用于瞬时表达蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤：

S1：将冻存的HEK293细胞在原始培养基里复苏，将HEK293细胞在37℃培养箱中孵育；

S2：当HEK293细胞活率≥95％且生长处于对数中期时，开始进行驯化；

S3：每2-3天进行一次传代操作，以保持HEK293细胞处于早期对数生长期，细胞接种密度为0.3～0.6×10⁶细胞/mL；

S4：当细胞密度达到3～4×10⁶细胞/mL且细胞活率≥95％，2～4天时，再次传代培养HEK293细胞；

S5：细胞密度达到约3～4×10⁶个活细胞/mL，活率≥95％时，准备转染质粒，转染前一天，将HEK293细胞按2～4×10⁶细胞/mL的细胞密度接种，并使HEK293细胞生长过夜；

S6：在第二天，即转染当天，获取包括细胞密度和存活率的数据，进行转染的HEK293细胞活率应≥95％，使用新鲜的培养基将HEK293细胞稀释至2～4×10⁶细胞/mL；

S7：稀释质粒DNA，通过旋转和/或翻转混匀；

S8：将转染试剂充分混匀，并用培养基稀释转染试剂；

S9：将稀释后的转染试剂加到稀释后的质粒DNA中，旋转和/或颠倒或轻轻吹打2-3次进行混合，将混合物在室温下孵育约20分钟；

S10：将混合物缓慢添加至步骤S6的HEK293细胞中，在添加过程中轻轻摇动；

S11：放回37℃培养箱中培养，在转染第二天，在瞬时表达过程中，维持葡萄糖浓度在4g/L以上，当细胞活率低于60％时收获HEK293细胞和表达产物。

2.根据权利要求1所述的体外培养HEK293细胞用于瞬时表达蛋白的方法，其特征在于：在步骤S1中，所述的HEK293细胞的细胞数量为细胞数量1×10⁷。

3.根据权利要求1所述的体外培养HEK293细胞用于瞬时表达蛋白的方法，其特征在于：在步骤S1中，所述的培养箱中的转速为125±5rpm，培养箱中CO₂浓度设置为8％。

4.根据权利要求1所述的体外培养HEK293细胞用于瞬时表达蛋白的方法，其特征在于：在步骤S7和步骤S8中，按照DNA：1～2mg/L；转染试剂：2～4mg/L的转染体系转染质粒和转染试剂。

5.根据权利要求1所述的体外培养HEK293细胞用于瞬时表达蛋白的方法，其特征在于：在步骤S11中，在转染后16-22小时向HEK293细胞添加补料，在添加过程中轻轻晃动HEK293细胞，放回37℃培养箱。

6.根据权利要求1-5任一项所述的体外培养HEK293细胞用于瞬时表达蛋白的方法，其特征在于：所用的培养基为HEK293无血清培养基，所述的HEK293无血清培养基由如下组分组成：

7.根据权利要求1所述的体外培养HEK293细胞用于瞬时表达蛋白的方法，其特征在于：在日常传代中，直接将HEK293细胞接种到HEK293无血清培养基中进行培养。

8.根据权利要求1-6任一项所述的体外培养HEK293细胞用于瞬时表达蛋白的方法，其特征在于：所述蛋白为抗体。

9.根据权利要求6所述的体外培养HEK293细胞用于瞬时表达蛋白的方法，其特征在于：所述抗体为CD20单抗、PD-1单抗；所述重组蛋白重组人凝血因子VIII。

10.根据权利要求6所述的体外培养HEK293细胞用于瞬时表达蛋白的方法，其特征在于：步骤S1-S11的顺序可以变化。