[发明专利]一种Ad-NK4修饰的DC疫苗构建方法

说明书

本发明提供了一种Ad‑NK4修饰的DC疫苗构建方法。该技术方案首先制备人多发性骨髓瘤细胞裂解物，同时从多发性骨髓瘤患者外周血分离DC，并利用Ad‑NK4转染，最后，利用人多发性骨髓瘤细胞裂解物致敏由Ad‑NK4转染后的DC，从而获得Ad‑NK4修饰的DC疫苗。在此基础上，分别通过体内实验和体外实验考察了该疫苗的免疫效力。结果证实，本发明所构建的DC疫苗在体外可显著抑制MM细胞的增殖，同时具有诱导凋亡作用，在细胞增殖、细胞周期、凋亡及Akt‑mTOR相关蛋白的表达均有明显的变化；体内实验部分，以本发明疫苗给药的实验组，其肿瘤的体积明显较小，肿瘤明显得到抑制，从而证实了本发明的技术效果。

技术领域

本发明涉及疫苗技术领域，具体涉及一种Ad-NK4修饰的DC疫苗构建方法。

背景技术

树突状细胞，是机体功能最强的专职抗原递呈细胞，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟DC具有较强的迁移能力，成熟DC能有效激活初始T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。

DC肿瘤疫苗是将肿瘤细胞的DNA，RNA，肿瘤细胞裂解物，肿瘤抗原蛋白/多肽等致敏DC细胞，利用DC强大的呈递功能，激活患者体内的T细胞免疫应答，从而发挥治疗肿瘤的作用。但是肿瘤免疫抑制(TME)大大限制了DC肿瘤疫苗的发展，常规DC疫苗的免疫效力不够理想。

NK4是一种HGF特异性拮抗剂，也是血管形成抑制剂，因其能够阻断HGF/c-Met途径和肿瘤血管形成而成为抗肿瘤治疗的策略之一。本申请人既往的研究表明，在转染条件下Ad-NK4对树突状细胞的免疫功能具有改善作用，然而，如何在分子层面构建Ad-NK4修饰的DC疫苗，以实现对骨髓瘤的免疫治疗，目前尚无可以借鉴的现有技术。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种Ad-NK4修饰的DC疫苗构建方法，以解决常规DC疫苗对骨髓瘤免疫效果较低的技术问题。

本发明要解决的另一技术问题是，如何在分子层面构建Ad-NK4修饰的DC疫苗。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种Ad-NK4修饰的DC疫苗构建方法，包括以下步骤：

1)制备人多发性骨髓瘤细胞裂解物；

2)从多发性骨髓瘤患者外周血分离DC，并利用Ad-NK4转染；

3)利用步骤1)的人多发性骨髓瘤细胞裂解物致敏步骤2)转染后的DC。

作为优选，步骤1)包括以下步骤：收集U266细胞，1000rpm离心5min，PBS重悬；液氮冷冻1min，而后在37℃环境下融解，重复3次；5000rpm离心10min，收集上清，经0.22μm孔径滤器过滤并收集，检测其中蛋白浓度。

作为优选，步骤2)包括以下步骤：取多发性骨髓瘤患者的外周血，获取外周血单个核细胞PBMNCs，采用CD14磁珠分选收获的PNMNCs；收获的CD14⁺的PBMNCs，用终浓度100ng/ml的rhGM-CSF和终浓度50ng/ml的rhIL-4诱导分化为DCs；以Ad-NK4转染DCs。

作为优选，步骤3)包括以下步骤：在DC培养的第6天，室温下融解U266细胞裂解产物，根据所测蛋白浓度加入蛋白溶液，至终浓度为100μg/ml，以致敏不同处理组诱导培养的DC，在37℃、5％CO₂培养箱中孵育12h；收集促成熟的DC，1000rpm离心5min，即得到Ad-NK4修饰的DC疫苗。

作为优选，步骤1)中，在液氮冷冻前，对重悬液中的细胞进行计数。

作为优选，步骤1)中，在液氮冷冻过程中，重悬液容纳于冻存管中，每管1.5ml。