[发明专利]一种新型循环肿瘤细胞的鉴定技术

说明书

本发明提供一种新型循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell,CTC)的鉴定技术，其特征在于：肿瘤患者体液(如外周血)经标准取样、运输存放、样本前处理、CTC富集分离于微孔滤膜上、固定细胞、细胞银染和免疫荧光原位检测步骤，从核质比例、不规则核仁特征及数量来确定是否是肿瘤细胞，最后通过组织器官特异性蛋白标志物的荧光免疫检测，确定血液中CTC的器官组织来源。本发明在原位镜检CTC，既检测肿瘤细胞,又确定循环肿瘤细胞的器官组织来源,解决长期以来CTC形态学鉴定缺乏令人信服的方法，有助于为CTC的检测建立统一的标准。本发明具有易于操作、重复性好、稳定性强等优点,可用于肿瘤高危人群的早期筛查、癌症患者的疗效评估及复发监控。

技术领域

本发明属于医学诊断技术领域，具体涉及一种新型循环肿瘤细胞(CirculatingTumor Cell,CTC)的鉴定技术。

背景技术

肿瘤可分实体瘤及非实体瘤二大类，前者由上皮或内皮组织细胞分化而形成的肿块，而后者是造血系统细胞形成的，如淋巴细胞癌，不形成肿块。肿瘤细胞从实体肿瘤原发灶或转移灶脱落，进入人体循环系统而形成循环肿瘤细胞(CTC)，存在于外周血中。

CTC以游离的单个细胞形式存在，或呈细胞团(Circulating Tumor Microemboli,CTM)形态。这些细胞是肿瘤转移的基础，研究CTC有助于揭示恶性肿瘤发生及转移的机制，CTC也用于临床疗效评估及复发监控。CTC在肿瘤患者外周血中十分稀少,每5毫升外周血仅含数个至数百个CTC，而每毫升成人外周血存在数百万白细胞及数亿红细胞，为此对CTC检测技术的灵敏度和特异性提出了极高的要求。CTC鉴定是肿瘤液体活检(Liquid Biopsis)的重要组成部分,其无创或微创及实时动态检测的优点,是当今肿瘤诊疗的重要方向,有广阔的应用前景。

目前针对CTC，有许多的检测方法，尤其CTC的检测主要包括CTC分离和富集系统以及鉴定系统，合适的分离和富集系统是能否有效检测外周血CTC的前提。用于临床实验研究的CTC分离和富集技术，主要根据CTC物理性质(如大小、密度等性质)和CTC表面与捕获基质的亲和性(如CTC表面的特异性抗原与带有相应抗体的相互作用)。由于CTC的高度异质性,基于某一CTC类型的特性去富集,有可能造成其它CTC类型的缺失而造成漏检。一些血细胞具有CTC相近的物理性质,以此性质来分离CTC,会同时富集这些血细胞。此外不少肿瘤细胞特异性抗原尚未知,理想的抗体常常缺乏。

常用的CTC分离富集技术有以下几类:

(1)密度梯度离心法(Density Gradient Centrifugation，DGC):基于血液中各种细胞与CTC密度的差别，在密度梯度介质中的沉降系数不同，将细胞悬液置于分离液介质的顶部，通过重力或离心力的作用，将CTC与其它细胞层分离。该法操作简便、成本低，但要求血量较大，且灵敏度和特异性均较低，CTC与白细胞等单核细胞在同一密度梯度,且操作过程中会损失CTC。

(2)上皮性肿瘤细胞过滤技术(Isolation by Size of Epithelial TumorCells，ISET):ISET方法是基于细胞大小不同用具有一定孔径的微孔滤膜来筛选。肿瘤细胞的直径一般为15～30μm，大于大多数血细胞的直径(如红细胞5～9μm)，所设计的微孔滤膜(直径8或10μm)过血液样本后将直径大的肿瘤细胞分离出来。该方法对技术、设备要求不高，但不适合直径小于滤膜孔径的肿瘤CTC的分离富集。