[发明专利]重组杆状病毒表达的鳜鱼弹状病毒糖蛋白的制备方法

说明书

本发明公开了一种重组杆状病毒表达的鳜鱼弹状病毒糖蛋白的制备方法，包括：引物设计与合成：目的基因的扩增与纯化；重组供体质粒pFastBac‑G的构建；重组穿梭质粒rBacmid‑G的构建；重组杆状病毒的制备；目的蛋白的纯化及Western blot检测。本发明可以获得大量抗原性、免疫原性较好的、与天然蛋白功能相似的可溶性重组蛋白，适用于鳜鱼弹状病毒糖蛋白的高效表达及DNA疫苗制备。

技术领域

本发明涉及一种重组杆状病毒表达的鳜鱼弹状病毒糖蛋白的制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

杆状病毒表达系统(Baculovirus expression system,BES)是目前应用最广泛的蛋白表达系统之一，常用于药物开发、疫苗、促生长因子、癌基因、抑癌基因蛋白产物、某些致瘤病毒蛋白、免疫活性分子、基因表达调控等领域。用杆状病毒做载体，可高效表达外源基因，到目前为止已有几百个包括动植物、病毒、细菌、真菌的基因在昆虫细胞或幼虫体内得到高效表达。这个表达体系的主要特点是可以获得大量抗原性、免疫原性较好的，与天然蛋白功能相似的可溶性重组蛋白。重组杆状病毒感染昆虫细胞后，可以对外源蛋白进行许多真核细胞的转录后加工作用，包括糖基化、磷酸化、酰基化、正确的信号肽切割、蛋白水解以及适当的折叠作用，而且还可将重组蛋白聚集定位于天然蛋白的同一细胞器上，还能进行适当的寡聚化装配。因此是表达有生物活性的蛋白质的理想载体。

鳜鱼弹状病毒(Sinipercachuatsirhabdovirus,SCRV)属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)。1999年从患病鳜鱼体内分离出来，SCRV主要感染鳜鱼，在鳜鱼流行病发生的疫区收集有典型病症的鱖鱼，病鳜鱼的症状主要表现为吻端、头部皮肤、背鳍和尾鳍基部充血或有出血点，有的鱼眼球突出，腮、鳃因缺血而发白，内脏局部出血，腹水肠内充满黄色粘稠物，不久便死亡。目前尚无有效治疗方法。对于该病毒的尚未研制出有效的疫苗与治疗方法，糖蛋白作为其重要的抗原目前尚未有使用杆状病毒表达系统的研究。

在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA片段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过IPTG诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难；而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种重组杆状病毒表达的鳜鱼弹状病毒糖蛋白的制备方法，可以获得大量抗原性、免疫原性较好的、与天然蛋白功能相似的可溶性重组蛋白，适用于鳜鱼弹状病毒糖蛋白的高效表达及DNA疫苗制备。

为解决上述技术问题，本发明提供一种重组杆状病毒表达的鳜鱼弹状病毒糖蛋白的制备方法，包括：

设计并合成引物GF、GR，所述引物GF、GR的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示；

以鳜鱼弹状病毒基因组为模板，以GF、GR为引物扩增糖蛋白基因；

采用双酶切法酶切载体和糖蛋白基因，回收纯化后用连接酶连接再转化至感受态细胞，涂布筛选阳性克隆，挑取阳性克隆扩大培养后提取质粒再进行鉴定，得到重组供体质粒；

将测序正确的重组供体质粒转化至感受态细胞，涂布进行蓝白斑筛选，纯化后经PCR及测序鉴定，得到重组穿梭质粒；

将重组穿梭质粒转染Sf9细胞，收集上清获得重组杆状病毒并扩大培养；