[发明专利]一种基于Collagel凝胶支架法三维培养纤维环源干细胞的方法

说明书

本发明属于生物技术及细胞培养技术领域，具体涉及一种基于Collagel凝胶支架法三维培养纤维环源干细胞的方法。本发明所述方法以Collagel凝胶支架作为三维基质，通过将纤维环源干细胞与Collagel凝胶混合为细胞悬液进行培养，可以更好的模拟细胞生长所需的类组织样物理和空间三维结构，能更好的模拟体内生理环境的不同生物力学作用下细胞生长的微环境，促进纤维环源干细胞生长、增殖、粘附、分化等生物学功能，更适用于椎间盘组织修复和纤维环组织再生等医学组织工程领域以及生物力学领域的研究。

技术领域

本发明属于生物技术及细胞培养技术领域，具体涉及一种基于Collagel凝胶支架法三维培养纤维环源干细胞的方法。

背景技术

椎间盘退变是一种常见疾病，尤其是随着人口老龄化和人们工作生活方式的改变，椎间盘突出、椎管狭窄等脊柱退行性疾病的发生率不断升高，部分症状严重患者甚至需要接受手术治疗。目前，髓核摘除和椎间融合是脊柱退行性疾病的主要手术疗法，但术中却不可避免地会造成纤维环的缺损。

纤维环是指位于椎间盘的周缘部、由纤维软骨组成的纤维组织，纤维环的纤维在椎体间斜行，并在横切面上排列成同心环状，相邻环的纤维具有相反的斜度，而相互交叉。纤维环的前方有坚强的前纵韧带，前纵韧带的深层纤维并不与纤维环的浅层纤维融合在一起，却十分加强纤维环的力量；而纤维环的后方有后纵韧带，并与之融合在一起，后纵韧带虽较前纵韧带为弱，亦加强纤维环后部的坚固性。简言之，纤维环在吸收震荡和保持髓核组织形态上发挥了重要作用。纤维环的损坏会导致椎间盘不再处于密闭环境，而椎间盘压力降低等一系列微环境改变均不利于椎间盘的修复和再生，术后长时间很可能会出现邻近节段退变、继发性脊柱不稳等一系列问题。因此，纤维环的完整性对限制髓核的突出及维持椎间盘的功能尤为重要。纤维环源干细胞具有向纤维环不同原始细胞分化的能力，利用组织工程技术重建纤维环结构可能成为比较理想的治疗方式。

研究表示，在体外建立模拟体内的三维生长环境，对于体外培养的纤维环源干细胞具有更好的促进生长及分化作用，尤其是体外建立适合细胞生长的生理微环境对纤维环源干细胞行为及生理功能具有重要影响。传统的经单层平面培养的细胞，由于无基质支持，纤维环源干细胞仅能贴壁生长，导致细胞的形态特征、基因表达、生长分化能力等均与天然的生理环境有所差异，无论是在细胞形态、结果和功能等多方面都与体内自然生理环境生长的细胞想去甚远，不利于纤维环源干细胞在椎间盘组织修复和纤维环组织再生中的应用，以及医学组织工程学的研究。

三维细胞培养技术(three-dimensionalcell culture，TDCC)是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，构成三维的细胞-载体复合物。三维细胞培养技术可提供类似体内生长环境的三维支架或基质，模拟细胞生长的体内生理环境，形成三维生长架构，促进细胞建立起细胞间及细胞与细胞外基质的联系，促进细胞近似于体内的基因表达、基质分泌及细胞功能活动。

目前，纤维环源干细胞的三维培养法主要包括海藻酸钙凝胶、琼脂糖凝胶及Matrigel凝胶法。其中，海藻酸钙凝胶法虽然操作时条件温和，对活细胞损伤小，但固定后却存在机械强度不高的缺陷；琼脂糖凝胶虽具有较大的空隙，允许大分子物质自由扩散，却更适合培养悬浮细胞；Matrigel凝胶法，是通过将生长状态良好的纤维环源干细胞经胰蛋白酶消化后，与Matrigel基质胶混悬后快速接种于培养板内，待形成凝胶后加入低糖DMEM完全培养基进行常规培养，整个过程存在步骤复杂、成本较高的缺陷，并且无法在生理环境的不同生物力学状态下保持长时间的高度凝胶状态，导致三维基质结构容易破坏，培养的纤维环源干细胞粘附能力较差，从而失去三维结构的支撑，细胞与细胞或细胞外基质的相互作用减弱，影响到细胞的生长和分化功能，不利于模拟体内生理性生物力学环境下，纤维环源干细胞生长的研究。