[发明专利]FLT3-NKG2D双靶点CAR-T的构建与制备

说明书

本发明公开了FLT3‑NKG2D双靶点CAR‑T的构建与制备。本发明CAR属于双靶点第二代CAR，具有克服肿瘤免疫逃逸、增强肿瘤细胞的特异性识别和杀伤的功能。其与吉列替尼联用，能有效解决FLT3^mut+的难治性急性髓系白血病的治疗困境，为急性髓系白血病的治疗提供新的治疗策略。

技术领域

本发明涉及生物免疫细胞治疗领域，具体涉及FLT3-NKG2D双靶点CAR-T的构建与制备。

背景技术

2012年国际细胞治疗协会年会中指出生物免疫细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段。免疫细胞治疗是采集患者外周静脉血，在GMP实验室内分离外周血单个核细胞，在多种细胞因子诱导下，大量扩增出具有高效抗瘤活性的免疫效应细胞，再通过静脉、皮内注射、介入等回输到患者体内，达到增强患者免疫功能和杀伤肿瘤细胞的目的，常用的免疫细胞治疗手段包括CIK、DC、TIL、DC+CIK细胞等。但是，在临床上发现肿瘤时，一般已是中晚期，此时病人体内肿瘤细胞占优势，严重损害了机体的免疫功能，在这样的免疫系统微环境下，DC细胞功能受损，激活T细胞效率较低，攻击癌细胞能力不够，也不够精准；另外，肿瘤细胞通过低表达或不表达MHC分子的逃逸机制，逃脱免疫细胞的攻击。这就需要制造精密制导、精准打击的免疫细胞武器，克服MHC介导的杀瘤机制。于是，靶向性抗肿瘤细胞CAR-T技术应运而生。

嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)主要包括胞外抗原结合区、跨膜区和胞内区：胞外区主要是抗原特异性单克隆抗体单链可变区序列，包括重链可变区和轻链可变区，二者以铰链区连接；跨膜区是CD3、CD4、CD8、CD28等蛋白分子的跨膜区；胞内区主要是T细胞受体TCR/CD3复合物中的CD3ζ链或免疫球蛋白Fc受体FcεRIγ链，通常具有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAMs)，负责信号转导；CAR胞外区为配体，肿瘤相关抗原(TAA)本身则为受体，CAR一旦与TAA结合，即可通过由CD3ζ或高亲和性受体FcεRIγ的胞内区使T细胞活化发挥效应功能，输入体内的CAR-T细胞CARs与TAA结合后引起CAR-T细胞活化，表现为CAR依赖的杀伤、增殖及细胞因子释放，输注的CAR-T细胞在患者体内持续存在与潜在的疗效相关。

目前，多数的CAR-T细胞设计主要针对的是淋巴细胞白血病例如CD19-CAR T细胞，单一靶点的CAR-T细胞对肿瘤杀伤力度不够，而超大剂量CAR-T细胞容易导致严重并发症，例如细胞因子释放综合征(CRS)。而且单一靶点CAR-T细胞治疗易产生靶抗原丢失，导致CAR-T细胞治疗后肿瘤再次复发。

其次，目前大多数FLT3抑制剂单药治疗和单一CAR-T细胞治疗对急性髓系白血病OS(总体生存时间)改善不明显，对于针对难治性FLT3^mut+-AML也并未产生显著性效果，普遍缺少新的具有临床治疗转化意义的抗白血病免疫机制，来为FLT3^mut+-AML患者的治疗带来新希望。

发明内容

本发明的目的在于提供双靶点FLT3-NKG2D-CAR-T细胞联合吉列替尼在制备治疗FLT3^mut+急性髓系白血病治疗药物中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供：

一种双靶点CAR-T细胞，可同时表达FLT3单链抗体和NKG2D受体的基因序列。

进一步地，上述FLT3单链抗体基因序列为FLT3(EB10)SCFV基因序列，基因序列为：