[发明专利]一种新型的钠钾ATP酶的检测方法

说明书

目前用于评估钠钾ATP酶活性较为常用的方法为放射性示踪法或比色法。但这两种方法均存在缺陷，前者需要使用放射性同位素，对实验环境要求高；后者则在检测准确度、灵敏度与重复性上相对较弱。本发明引入一种新方法进行细胞钠钾ATP酶活性的检测，通过电感耦合等离子体质谱法(ICP‑MS)精确定量转运进细胞的铷离子，由此测得细胞内铷离子的转运率，进而评估钠钾ATP酶的活性。此方法具有无放射性、可靠、准确等优点。

技术领域

本发明涉及检测ATP酶活性领域，具体涉及通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)的方法检测细胞钠钾ATP酶对铷离子(Rb⁺)跨膜转运量的方法来评估钠钾ATP酶的活性。

背景技术

钠钾ATP酶(Na，K-ATPase)，又名Na⁺-K⁺泵，于1957年由J.C.Skou所发现，由α、β两亚基组成。α亚基为分子量约为120kD的跨膜蛋白，既有Na+、K+结合位点，又具ATP酶活性。β亚基为小亚基，是分子量约为50kD的糖蛋白。钠钾ATP酶存在于所有真核细胞中，是一种金属离子转运蛋白，每消耗一个ATP分子，逆电化学梯度泵出3个钠离子和泵入2个钾离子，保持膜内高钾，膜外高钠的不均匀离子分布，由此维持细胞膜静息电位的稳定、离子、渗透压与pH平衡，发挥着非常重要的细胞功能。经科学研究发现钠钾ATP酶在人体的正常代谢中具有非常重要的作用，与一些疾病的发生也有着密切的关系，如脑水肿、白内障、囊纤维化、癫痫、偏头痛、高血压等。

目前，用于评估钠钾ATP酶活性较为精确的方法主要是检测该转运蛋白对放射性86Rb的转运效率，通常由放射性示踪法来确定，采用伽马计数仪检测86Rb，但这种方法需要使用放射性同位素，对实验操作环境要求高，限制钠钾ATP酶的快速检测。也有采用比色法对钠钾ATP酶活性进行检测，其原理在于在含Na⁺，K⁺、Mg²⁺的缓冲液中，加入ATP和酶，在37℃温育10min后，ATP被酶分解成ADP和无机磷(Pi)，在酸性环境中，定磷试剂中的钼酸铵以钼酸形式与样品中的磷酸反应生成磷钼酸，当有还原剂存在时磷钼酸立即转变蓝色的还原产物钼蓝，钼蓝在650-660nm波长处有最大的吸收。以每毫克蛋白每小时新产生的Pi量为酶的活性单位，所得结果为总ATP酶活性。缓冲液中加Na⁺，K⁺-ATP酶的特异性抑制剂哇巴因，所得结果为Mg²⁺-ATP活性，两者之差即为Na⁺，K⁺-ATP酶活性。比色法的对实验环境要求不高，但灵敏度较低。

发明内容

发明目的：提供一种基于电感耦合等离子体质谱(Inductively coupled plasmamass spectrometry，ICP-MS)检测方法，用于测定真核细胞膜钠钾ATP酶活性的方法。

技术方案：针对背景技术中的情况，本发明选用⁸⁶Rb的无放射性替代物氯化铷(RbCl)，采用电感耦合等离子体质谱法(Inductively coupled plasma massspectrometry，ICP-MS)测定Rb⁺跨膜转运量来评价钠钾ATP酶的活性。Rb⁺与K⁺为同系物，以同样方式经Na⁺，K⁺-ATP酶摄入细胞内，且Rb⁺是自然状态下细胞内不存在的离子，环境干扰小，易于检测。因此，通过仪器检测转运进细胞的Rb⁺，可以估钠钾ATP酶的活性。