[发明专利]吡咯伯克霍尔德氏菌内切葡聚糖酶及其重组表达方法和应用

说明书

本发明公开从吡咯伯克霍尔德氏菌B1213克隆的内切葡聚糖酶基因，采用含有可溶性融合标签的pCold TF载体(使用TF)和cspA启动子成功得以表达。通过酶活性，SDS‑PAGE和酶谱分析成功地表达了带有或不带有信号肽的所述酶，其中切除信号肽更好。通过优化培养条件后，酶活性提高至未优化前的11.5倍。同时对该酶的酶学性质研究表明，该酶最适pH为6.0，最适反应温度为45℃；该酶在20‑35℃下保温半小时后残余酶活可达80％以上，且在pH5.5‑11.0环境中保温半小时后残余酶活保持在95％以上，具有极强的耐碱性，该酶具有很好的工业应用潜力。

技术领域

本发明属于基因工程领域，尤其涉及葡聚糖酶，及其编码基因重组表达方法和在降解纤维质材料中的应用。

背景技术

内切β-1,4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)(EG)是一种水解酶，可催化纤维素，谷物β-D-葡聚糖和谷物中的β-1、4-D-糖苷键水解。EG由于其潜在的用途多样性而受到了广泛的关注，例如生产低聚葡寡糖，降低糖化液的粘度和提高酿造过程中的麦汁分离效率，提高饲料的消化率，控制植物病原真菌，并生产生物乙醇[Huang JF,Xia T,Li GH,Li XL,Li Y,WangYT,Wang YM,Chen YY,Xie GS,Bai FW,Peng LC,Wang LQ(2019)Overproduction ofnative endo--1,4-glucanases leads to largely enhanced biomasssaccharification and bioethanol production by specific modification ofcellulose features in transgenic rice.Biotechnol Biofuels 12.http://doi.org/10.1186/s13068-018-1351-1]。此外，新一代利用木质纤维素残留物的可再生能源已成为克服环境问题最有可能的战略之一，这些环境问题包括能源消耗增加，化石燃料资源枯竭以及减轻全球变暖的必要性。用酶水解木质纤维素是理想的方法，并有望以环保和高效的方式加以利用。EG可以将糖苷键随机水解成短链，所以它在木质纤维素水解过程中起着重要的作用。EG是由各种细菌，真菌和植物广泛产生的。尽管有较多真菌来源的EG被确定和进行了相关性质分析，但是细菌来源的较少研究，而细菌来源的一般对环境极端条件的稳定性和耐受性较高，因此细菌在EG生产中具有很高的潜力[Maki M,Leung KT,Qin WS(2009)The prospects of cellulase-producing bacteria for the bioconversion oflignocellulosic biomass.Int J Biol Sci 5:500-516.http://doi.org/doi:10.7150/ijbs.5.500]。