[发明专利]一种快速检测保健品中西地那非的方法

说明书

本发明公开了一种快速检测保健品中西地那非的方法，包括筛选西地那非单克隆抗体和制备西地那非抗体‑荧光微球偶联物，以及构建荧光检测试纸条，所有结合分离步骤均在亲和柱中完成，避免了亲和位点被破坏，增强了检测的荧光信号,其中荧光检测试纸条由样品垫、结合垫、NC膜和吸水纸组成，本发明所建立的西地那非检测方法IC50为26.8ng/mL，线性范围为1～81ng/mL(y＝‑0.16lnx+0.65(R2＝0.97)，故适用于保健品中非法添加西地那非的快速检测，整个检测过程仅需15min，且无需使用大型设备，具有操作简便、灵敏度高、结果可靠，可用于保健品中西地那非非法添加药物的定性和半定量筛查分析。

【技术领域】

本发明涉及保健品的检测方法，尤其是一种快速检测保健品中西地那非的方法。

【背景技术】

西地那非，分子式为C₂₂H₃₀N₆O₄S，为环磷酸鸟苷cGMP特异性5型磷酸二酯酶PDE5的选择性抑制药，是治疗男性勃起功能障碍ED的口服药物，一般以其商业名称伟哥Viagra而广为人知。如果长期或超剂量服用此药物可对心血管系统、神经系统、消化系统等造成严重的损伤，因此我国明令禁止在食品包括保健品中添加西地那非。但是一些不法商人为了追求理想治疗效果、短时间见效，会在抗疲劳类、壮阳类保健品中违法添加此违禁药物，以达到非法盈利的目的，无疑给消费者带来了巨大的安全隐患。

现有技术中用于检测西地那非的方法有很多，主要有液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、离子迁移谱、薄层色谱法、毛细管电泳法、红外光谱法等。尽管这些方法能够检测西地那非及其类似物，但所用仪器大多昂贵、样品前处理复杂，耗时长，对检测人员的专业技术要求较高，且无法实现现场快速检测的需要。ELISA法为竞争性酶联免疫反应，虽然可缩短西地那非检测时间，且对仪器及专业技术人员要求不高，但是需要多种配套试剂，操作过程仍较复杂，而且一般只能实现定性检测，达不到定量检测的目的。

本发明即针对现有技术的不足而研发提出。

【发明内容】

本发明要解决的技术问题是提供一种快速检测保健品中西地那非的方法。首先通过细胞融合技术，筛选得到西地那非单克隆抗体，然后基于抗体亲和位点保护标记方法制备了西地那非抗体-荧光微球偶联物，最后成功地构建了荧光检测试纸条。本发明基于抗体亲和位点保护标记方法，其操作简单稳定，所有结合分离步骤均在亲和柱中完成，可以有效避免亲和位点被破坏，大大增强了检测的荧光信号。另外，本发明发荧光检测试纸条由样品垫、结合垫、NC膜和吸水纸组成。将包被原和羊抗鼠多抗喷涂于NC膜上，分别作为西地那非试纸条检测线(T线)和质控线(C线)，结合垫喷有西地那非抗体偶联荧光微球，最后将吸水纸、NC膜、结合垫和经过预处理的样本垫顺序粘贴在PVC底板上，用自动切条机切成4mm宽的试纸条。本发明建立的西地那非检测方法IC50为26.8ng/mL，线性范围为1～81ng/mL(y＝-0.16lnx+0.65(R²＝0.97))。该方法适用于保健品中非法添加西地那非的快速检测，整个检测过程仅需15min，且无需使用大型设备。本发明所制备的基于荧光微球层析的试纸条其操作简便、灵敏度高、结果可靠，可用于保健品中西地那非的定性和半定量筛查分析。

本发明一种快速检测保健品中西地那非的方法，具体步骤如下：

A、免疫原的合成,分别取西地那非免疫半抗原和西地那非包被半抗原，采用活泼酯法，将半抗原分别偶联于载体蛋白BSA和OVA，获得免疫原AT-BSA和包被原ATA-OVA，并通过紫外扫描鉴定半抗原与BSA和/或OVA是否偶联成功；

B、筛选西地那非单克隆抗体,将免疫原免疫实验BALB/C小鼠后，取小鼠脾脏B细胞与瘤细胞进行细胞融合，通过单克隆细胞技术进行筛选，并植入小鼠腹腔产生腹水,收集腹水后，通过Protein A柱进行分离纯化，冻干长期保存；