[发明专利]一种用于治疗细胞分泌蛋白检测的微流控芯片及制备方法

说明书

本发明公开了一种用于治疗细胞分泌蛋白检测的微流控芯片及制备方法，该芯片包括微腔阵列芯片和抗体条形码衬底，所述抗体条形码衬底覆盖于微腔阵列芯片上方；所述微腔阵列芯片为生物亲和芯片，其微腔壁修饰有石墨烯纳米材料，所述抗体条形码衬底上印刷有功能捕获抗体，所述功能捕获抗体位于微腔顶部。本发明所公开的微流控芯片可以改善细胞培养环境，有利于细胞生长，捕获抗体效率高，均匀性好，分析结果更加准确，其制备方法工艺简单，成本低廉，适合于大规模生产。

技术领域

本发明涉及单细胞分析领域，特别涉及一种用于治疗细胞分泌蛋白检测的微流控芯片及制备方法。

背景技术

生物治疗细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段，传统需要分离外周血单个单核细胞，在多种因子诱导下，大量扩增出具有高效抗瘤活性的细胞，再通过静脉、皮内注射、介入等回输到患者体内，达到增强患者免疫功能和杀伤肿瘤细胞的目的，常用的细胞治疗手段包括CIK、DC、TIL、DC+CIK细胞等。

在临床上发现肿瘤时，一般已是中晚期，此时病人体内肿瘤细胞占优势，严重损害了机体的免疫功能，在这样的免疫系统微环境下，细胞功能受损，激活治疗细胞效率较低，攻击癌细胞能力不够，也不够精准；另外，肿瘤细胞通过低表达或不表达MHC分子的逃逸机制，逃脱免疫细胞的攻击。这就需要制造精密制导、精准打击的细胞武器，克服MHC介导的杀瘤机制，于是靶向性抗肿瘤细胞的CAR-T，CAR-NK、治疗干细胞技术应运而生。但是，有研究发现这些治疗细胞对人体具毒副作用，Kaufman团队将人卵巢癌细胞移植到免疫抑制小鼠体内，将CAR-NK细胞注入动物模型，用CAR-T细胞作为对照，发现与接受CAR-NK细胞治疗的动物相比，CAR-T细胞治疗的动物肝脏、肺和肾等器官受到较为严重的损害。体内炎症细胞因子水平增加，治疗细胞让小鼠感到不适，症状为体重减轻，治疗细胞技术应用于临床，需要进一步对其进行单细胞功能分析，充分理解治疗细胞工作的潜在机制。

在过去的几年中，细胞分离和蛋白质分泌分析的创新策略取得了进步，从而实现了单细胞分离。其中，液滴微流控技术已被证明是用于单细胞分选和分析的有前途的平台。该技术主要涉及将单个细胞封装在装有特异性荧光抗体或酶的液滴中，以捕获和检测分泌的细胞因子。尽管该技术具有单细胞分离的功能。但是，随后的细胞因子定量需要使用流式细胞仪，这会增加整个系统的复杂性，并且无法实现原位检测，特别是贴壁细胞的正确检测。并且该方法所使用的流式细胞仪虽然可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，但是流式细胞仪是一种零时间分辨率的仪器，它只能测量细胞的某一时间点诸如总核酸量，总蛋白量等指标，而不能对细胞动态监测，也无法实时在单细胞水平对细胞进行后续分析处理，它的细节分辨率为零，并且价格昂贵，不适用于大众。

对于某些应用，流式细胞术仍然受到一定程度的限制。细胞必须处于悬浮状态，这意味着组织需要解离，从而导致细胞功能和细胞-细胞相互作用以及组织结构的丧失。具有相似标记表达的亚群难以区分，并且荧光染料之间的发射光谱重叠可能会导致噪声水平升高，从而使低强度样品不可用于检测。此外，流式细胞术的分选系统对细胞活力可能具有不可忽略的影响。除此以外，流式细胞仪系统的最小样品量为几百微升至几毫升。较长的管路导致无法使用稀有样品，尤其是在需要分析整个样品时。最后，由于由非一次性组件组成的复杂系统，一般来说流式细胞术难以实现无菌操作。

聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)具有良好的光学性能、热稳定性和生物兼容性等优点，是微流控芯片的主要加工材料之一。近年来，以PDMS为材料加工的芯片，即PDMS微流控芯片已逐步成为低成本、便携式和环保型生化微量检测工具。基于PDMS材料的芯片，已在细胞操纵、细胞内基因表达检测、细胞培养、免疫荧光分析等方面成功应用。在细胞培养方面，传统方法是在PDMS表面修饰有机生物活性材料，例如BSA等，但通过研究发现，修饰有机生物活性材料存在稳定性差，易染菌等问题，石墨烯纳米材料是一种新型无机生物基底材料，具有促进细胞黏附和增殖的作用，由于是新兴纳米材料，很少用在细胞培养方面。

发明内容