[发明专利]一种调控脂质代谢的复制型溶瘤腺病毒及其应用

说明书

本发明涉及肿瘤生物治疗领域，具体涉及一种抑制肿瘤生长和转移的复制型溶瘤腺病毒AD5‑ApoA1及其在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明公开了AD5‑ApoA1的设计和构建方法，成功获得了复制型溶瘤腺病毒AD5‑ApoA1；该病毒可以在肿瘤细胞内快速复制并产生溶瘤作用；感染该病毒的肿瘤细胞能够高表达载脂蛋白ApoA1，该蛋白分子能够大量分泌到胞外，显著抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移，抑制促肿瘤炎症通路、显著降低导致肿瘤免疫逃逸的关键分子IDO‑1；该腺病毒在肝癌、乳腺癌、结肠癌和肺癌的小鼠中，能显著抑制肿瘤生长、抑制肿瘤的侵袭、延缓恶液质的进展和延长荷瘤小鼠生存时间，有极大的开发抗肿瘤药物的前景和价值。

技术领域

本发明涉及肿瘤生物治疗领域，涉及一种有效抑制肿瘤生长和侵袭转移的复制型溶瘤腺病毒及其应用。

背景技术

我国每年新增的癌症患者约400万人，每年有近300万人死于癌症。传统的手术、放疗、化疗等方案在一定程度上抑制了肿瘤的进展，但难以控制肿瘤的侵袭、转移和复发。

近年来，肿瘤的生物治疗手段成为不可或缺的一部分。溶瘤病毒本身能够在肿瘤细胞中复制并发挥溶瘤作用，同时能够激活免疫细胞，导致肿瘤局部的免疫细胞浸润，并诱发抗肿瘤免疫应答。另外，溶瘤病毒可以携带外源基因，在肿瘤局部表达外源蛋白，直接发挥蛋白药物的抗肿瘤作用。2015年，第一个溶瘤病毒药物(T-Vec，Agmen公司)被FDA批准上市，重组的单纯疱疹病毒-1能够表达GM-CSF激活DC发挥抗肿瘤活性。现有技术中对溶瘤病毒的药物开发主要是通过构建重组表达载体使病毒释放免疫激活因子或免疫检查点抗体来激活患者免疫功能发挥抗肿瘤作用，如一种携带人穿膜肽p53与GM-CSF基因的重组溶瘤腺病毒(CN201310460980)，以及一种表达PD-L1单链抗体的新城疫溶瘤病毒(CN201811560794)。但目前现有的技术对肿瘤转移并不能进行有效控制。

载脂蛋白ApoA1是ApoA家族中最多的一种组分，在肝脏和小肠中合成，是由243个氨基酸残基所组成的单一多肽。ApoA1是卵磷脂胆固醇酰基转移酶的活化剂，主要存在于高密度脂蛋白(HDL)中，是HDL的主要载脂蛋白。ApoA1主要功能是介导胆固醇的逆向转运，即将胆固醇由外周细胞转运到肝脏。ApoA1通过与细胞表面的特异性受体三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)结合，摄取细胞的游离胆固醇和磷脂，生成新生的HDL。通过卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶(LCAT)，将HDL颗粒中的游离胆固醇转变为胆固醇脂，然后运输到肝脏进行代谢。现有文献报道，将载有ApoA1野生型(WT)或突变型(V156V)的脂蛋白体(PL)和溶瘤腺病毒耦联形成复合体，可以有效促进溶瘤病毒的对Hep3B细胞的抗肿瘤活性(MolCells.2012；34:143-148)。但该技术方案对肿瘤的侵袭，转移和复发未给出是否具有相应的技术效果。此外，该文献的方案是先通过体外构建二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)，游离胆固醇(FC)，ApoA1组成比为200:9:1的PL，再和溶瘤腺病毒形成复合物的方式发挥作用。这种方式不仅制备过程复杂，而且药物效应持续的时间较短暂。

因此目前尚缺乏一种能够表达脂质代谢相关的基因的复制型溶瘤病毒载体和溶瘤病毒，使其有效抑制肿瘤的生长，并能达到控制转移复发的效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种既能抑制肿瘤生长又能抑制肿瘤侵袭转移的复制型溶瘤腺病毒及其应用。

为实现上述发明目的，本发明采用了下列技术方案：

一种能够分泌载脂蛋白ApoA1的复制型溶瘤腺病毒载体和重组溶瘤病毒。具体地，该复制型溶瘤腺病毒载体的构建方案包括：实验级带标签的腺病毒载体和药用级无标签的腺病毒载体。实验级腺病毒复制元件E1A由第一组成型启动子CMV控制，在E1A上游连接GFP序列，中间由A2连接序列连接。E1区插入的外源目的基因ApoA1由第二组成型启动子CMV控制，ApoA1的5’端具有信号肽序列，3’端含有His标签序列及PA序列。