[发明专利]一种脐带间充质干细胞制剂的制备方法

说明书

本发明涉及一种脐带间充质干细胞制剂的制备方法，具体包括以下步骤：样本采集、样本运输、样本交接、样本检测、样本预处理、分离制备、原代培养、传代、冻存、细胞检测。本发明具有以下有益效果：细胞增殖分化能力强，杂细胞少，相对纯净，分离培养过程简单，工作量小，细胞爬出概率高，能够收获很大数量的间充质干细胞，满足大批量生产干细胞制品及临床应用的需要。

技术领域

本发明涉及细胞制备与再生医学技术领域，具体是指一种脐带间充质干细胞制剂的制备方法。

背景技术

干细胞是机体的起源细胞，是一类具有自我复制和多向分化潜能的细胞，可以在体外培养、扩增和定向诱导分化成多种细胞。根据其分化能力不同可以将干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞，成体干细胞存在于骨髓、脂肪、牙髓、脐带等组织中，成体干细胞的再生医学研究是近年来生物医学领域研究的热点之一，被广泛应用于神经系统疾病、骨科疾病、消化系统疾病、妇科疾病及抗衰老领域。

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是干细胞的一个研究分支，属于中胚层的一类早期未分化的多能干细胞，具有自我更新、自我复制、无限增殖及多向分化潜能等特点，主要存在于结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，随后还发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。目前,我们能够从骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、脐带血中分离和制备间充质干细胞，用得最多的是骨髓来源的间充质干细胞。但骨髓来源的间充质干细胞存在以下问题：随着年龄的老化，干细胞数目显著降低、增殖分化能力大幅度衰退；制备过程不容易质控；移植给异体可能引起免疫反应；取材时对患者有损伤，患者有骨髓疾病时不能采集，即使是健康供者，亦不能抽取太多的骨髓。这都限制了骨髓间充质干细胞临床应用，使得寻找骨髓以外其他可替代的间充质干细胞来源成为一个重要的问题。

人脐带间充质干细胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSC)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞。从脐带中分离出的MSC细胞，在细胞含量、增殖能力方面均优于骨髓MSC细胞，且免疫原性比骨髓MSC细胞低。与人胚胎干细胞(Human embryonic stem cells,hESC)、骨髓间充质干细胞(Adipose derivedmesenchymal stem cells,ADMSC)相比，hUCMSC具有更明显的优势：①成本较低，hUCs是医学废弃物；②来源丰富，全世界每年都会有数亿新生儿出生；③不会给捐献者造成新的创伤和痛苦；④不涉及伦理问题；⑤hUCMSCs是一种较为原始的干细胞，表达某些hESC的特征标志，具有极强的可塑性；⑥与BMSC和ADMSC相比具有更强的扩增能力；⑦无致瘤活性和低免疫原性；⑧与BMSC相比，不会随着传代次数增加和机体年龄增长导致增殖能力和分化能力降低。这些优势使hUCMSC可能成为一种更具潜力的种子细胞。

目前，从脐带组织中分离间充质干细胞的方法主要有2种方法，一种是酶消化法，另一种是组织块贴壁法。酶消化法的经济成本较高，酶的价格昂贵，通常还需配套的消化设备，消化时间长，且时间不易把控，消化时间不够，便无法得到足够数量的细胞，消化时间过久，酶对细胞有一定的损伤与老化，导致细胞贴壁能力与增殖活性不佳。组织块贴壁法操作简单，经济成本低，主要是利用是目前使用较为普遍的一种分离制备脐带间充质干细胞的方法，但是目前使用的组织贴壁法培养的细胞周期长，通常需要14-20天才能得到数量不多的原代细胞。

发明内容

本发明的目的在于提供一种脐带间充质干细胞制剂的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种脐带间充质干细胞制剂的制备方法，具体包括以下步骤：

步骤1)样本采集：选取来自正常足月分娩的新生儿脐带，在距脐带两端2-3cm处结扎，剪下结扎好的脐带置于装有30-50ml储存液的采集瓶中，并采集产妇外周血2ml用于传染病检测；