[发明专利]一种高效低毒的心肌纯化培养基及方法

说明书

本发明公开了一种高效低毒的心肌纯化培养基及方法，所述心肌纯化培养基为添加有乳酸盐、脂质和L‑肉碱的基础心肌纯化培养基。本发明的一些实例的培养基，可以出人意料地更快地纯化得到iPS‑CM，培养基组分对心肌细胞的毒性更低，可以更好地保持心肌细胞的活率。

技术领域

本发明涉及生物培养基及细胞培养方法，特别涉及一种高效低毒的心肌纯化培养基及方法。

背景技术

心血管疾病是当今社会的主要健康问题和死亡的主要原因。全球接近2千6百万人次正在遭受心力衰竭的痛苦，5年内的存活率少于53%。随着iPS技术的发展、心肌细胞分化及纯化方法的建立，使得人们可以在体外模拟患者心脏表型的心肌细胞。这些从iPS分化而来的心肌细胞（iPS-CM）可以模拟供者的心脏表型且不受伦理争议，使其可以协助我们研究心血管疾病的发病机制（如：长QT间期综合征，心律不齐，肥厚型心肌病，扩张型心肌病，线粒体心肌病，等）、评估药物的心脏毒性试验（如：醛固酮拮抗剂，血管紧张素转化酶抑制剂，血管紧张素Ⅱ受体阻断剂，β受体阻滞剂，血管紧张素脑啡肽酶受体抑制剂，等）以及成为心肌组织工程的种子细胞。

一般而言，细胞的活率会随着培养时间的延长而减弱，而诱导得到的iPS-CM中本身存在较多的非心肌细胞，未经纯化难以应用。现有的心肌细胞的纯化方法主要使用乳酸盐进行代谢选择，但此方法需要时间较长，一般需要6～10天，短时间内难以获得纯度较高的心肌细胞（参见Xu C. Differentiation and enrichment of cardiomyocytes fromhuman pluripotent stem cells[J]. Journal of molecular and cellularcardiology， 2012， 52(6): 1203-1212.），所使用的基础培养基为无糖DMEM培养基。发明人也尝试使用脂质（用于心肌细胞纯化培养的脂质一般包括一种或多种不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸，并添加有一定的乳化剂，使其可以均匀分散在培养基中）代替乳酸盐进行纯化，但脂质对细胞有一定毒性，虽然纯化速度较快，但细胞活率较差（参见：Lin B，Lin X，Stachel M，et al. Culture in glucose-depleted medium supplemented with fattyacid and 3，3′，5-triiodo-l-thyronine facilitates purification and maturationof human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes[J]. Frontiers inendocrinology， 2017， 8: 253.）。

如何在保持心肌细胞活率的情况下，快速纯化得到iPS-CM是有待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种高效低毒的心肌纯化培养基及方法。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供：

一种用于iPS-CM纯化培养基的添加剂，所述添加剂由乳酸盐、脂质和L-，肉碱组成，各组分在iPS-CM纯化培养基的添加量为：乳酸盐，2～4 mM；脂质 0.1～0.5v/v%；L-肉碱，2～10μM。

在一些实例中，L-肉碱的添加量为4～10μM。

在一些实例中，所述脂质的添加量为0.2～0.4v/v%。

在一些实例中，添加剂还包括pH稳定剂。

在一些实例中，所述pH稳定剂选自HEPES和MOPS中的至少一种。

在一些实例中，所述乳酸盐选自乳酸钠、乳酸钾、乳酸钙、乳酸镁、乳酸锌、乳酸亚铁。

在一些实例中，所述脂质含有花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸、十八烯酸中的至少一种脂肪酸。