[发明专利]一种通过人工干扰提高菊花黑斑病抗性的方法

说明书

本发明属于植物基因工程育种领域，涉及一种通过人工干扰提高菊花黑斑病抗性的方法，包括以下步骤：构建pMDC32‑amiCmKIC植物表达载体；采用农杆菌介导法将其转入菊花中，进行培养获得抗性植株。对转化植株进行PCR、定量RT‑PCR检测证实amiRNA在转录水平上影响靶基因CmKIC的表达。对转基因植株进行抗病性检测，发现与野生型植株相比，转基因植株抗病性有很大提高。本发明通过人工干扰CmKIC基因提高菊花的黑斑病抗性，为利用基因工程技术选育菊花抗病品种提供新颖而实用的方法，将有效推动菊花生物技术育种进程。

技术领域

本发明属于植物基因工程育种领域，涉及一种通过人工干扰提高菊花黑斑病抗性的方法。

背景技术

菊花(Chrysanthemum morifolium)是我国十大传统名花和世界四大切花之一，具有很高的观赏与经济价值。菊花生产过程中经常会有很多病害发生，其中由链格孢属真菌引起的黑斑病是最严重病害之一。链格孢属真菌侵染菊花后，产生圆形黑色斑点，随后逐渐扩大成圆形、近圆形或不规则形的病斑，潮湿条件下具有暗色霉层。近年来，菊花黑斑病的发生面积不断扩大，严重影响了菊花产量和观赏品质，给花卉生产造成了巨大损失。目前，黑斑病主要靠喷施杀菌剂防治，但常造成农药残留和环境污染等问题，不利于绿色可持续性发展。培育抗病品种是防治菊花黑斑病最经济、安全和有效的途径。

近年来，随着分子生物学的迅速发展，通过遗传转化的技术在植物体内过量表达或沉默特定的内源基因以提高植物抗逆性已成为现代育种的重要手段。基因沉默利用植物内源RNA沉默的原理，提供小的双链RNA靶序列沉默靶基因。人工小RNA干扰技术(Artificial microRNA technology，amiRNA)是一种在RNAi基础上发展出的基因沉默技术，具有特异性高、稳定性强和沉默效应可预见等优点。amiRNAs是一类由内源miRNA前体生成的长21mer的人工小RNA分子，它能特异性地对单个或多个靶基因进行高效、稳定的沉默。因而amiRNA是分析基因功能的有效工具之一，有望通过沉默内源基因提高植物的抗病性。在菊花中，通过沉默内源基因提高菊花黑斑病抗性还鲜有报道。目前，KIC基因在抗病育种中未见研究报道，具有明显创新性。因此通过农杆菌介导法沉默菊花的内源基因CmKIC提高其抗病性是一种新的探索，为采用基因工程技术选育菊花抗病品种提供新颖而实用的方法。

发明内容

本发明的目的在于解决现实生产中切花菊对黑斑病抗性较低的问题，提供一种通过人工干扰提高菊花黑斑病抗性的方法。本发明涉及的农杆菌介导遗传转化、转基因植物的分子检测及转基因植株后代对黑斑病的抗性分析为利用基因工程技术开展抗病性菊花分子育种提供方法和实例。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

利用根癌农杆菌介导法，对CmKIC基因进行人工干扰，并经过潮霉素筛选抗性植株；经过潮霉素抗性筛选得到阳性转化植株，对转化植株进行PCR、荧光定量RT-PCR验证，对转基因植株后代进行抗病性分析，最终获得抗病性提高的转基因菊花植株。CmKIC基因的MicroRNA序列由专门进行amiRNA研究的专业网站自动生成(http://wmd3.weigelworld.org/)，CmKIC基因的序列为SEQ ID NO.1，CmKIC基因的amiRNA即amiCmKIC序列为SEQ ID NO.3。

本发明的第一个目的是提供SEQ ID NO.1所示的CmKIC基因在提高菊花黑斑病抗性中的基因工程应用。

进一步的，所述应用为特异性沉默CmKIC基因提高菊花黑斑病抗性。

本发明的第二个目的是提供SEQ ID NO.3所示amiCmKIC在提高菊花黑斑病抗性中的基因工程应用。

本发明的第三个目的是提供一种通过人工干扰提高菊花黑斑病抗性的方法，所述方法包括以下步骤：