[发明专利]一种运用广泛靶向代谢组学技术鉴别荔枝品种的方法

权利要求书

1.一种运用广泛靶向代谢组学技术鉴别荔枝品种的方法，其特征是包括以下步骤：

(一)不同品种荔枝代谢物的质谱鉴定及峰面积数据库构建、差异代谢物筛选及heatmap图的构建；

(1)荔枝样品的制备：采集不同品种成熟期荔枝样品，采用有机溶剂提取，提取液经预处理，得待测液；

(2)荔枝样品的检测分析：将待测液采用超高效液相色谱和串联质谱仪采集质谱数据，获得多反应监测模式代谢物检测多峰图，对色谱峰进行积分和校正，每个色谱峰的峰面积代表对应物质的相对含量，获得所有色谱峰面积积分数据；

(3)荔枝样品定性定量分析：将质谱数据与现有数据库中的数据进行对比鉴定样品中的化学成分，建立不同品种的代谢物峰面积数据库；

(4)代谢组学数据的处理与分析：采用多元统计法进行分析，首先对检测到的代谢物进行主成分(PCA)分析，初步了解各组样本之间的总体代谢物差异和组内样本之间的变异度大小，然后用有监督模式的偏最小二乘判别分析法(PLS-DA)区分组间代谢物的总体差异并寻找差异代谢物，再通过正交偏最小二乘判别分析去除不相关的差异来筛选差异变量找出各组样本间的差异，建立OPLS-DA模型，分析模型的预测能力和可靠性，如模型有意义，再根据变量权重值(VIP)分析筛选其差异代谢物，获得不同品种荔枝样品的PCA得分图、PLS-DA得分图；

(5)共有差异显著代谢物的筛选：基于OPLS-DA分析，利用VIP值、P值筛选差异代谢物，并进行多重比较分析，选取VIP值≥1，P值＜0.01的变量作为共有差异显著代谢物；

(6)根据上述确定的共有差异显著代谢物种类及其相对含量，生成已知荔枝品种的显著差异代谢物的heatmap图，使数据可视化，显示不同品种荔枝样品中的共有差异显著代谢物的变化及差异，供待鉴定荔枝品种进行查询和比对；

(二)未知品种荔枝的制备、分析及鉴定

(7)选取待鉴定荔枝品种，按照上述步骤(1)-(3)，获得该品种的多反应监测模式代谢物检测多峰图，对色谱峰进行积分和校正，获得全部色谱峰面积积分数据，与已知品种库中的代谢物峰面积数据库合并，进行多元统计法进行分析，得到PCA图和PLS-DA图，初步判定该待鉴定品种与已知品种的组间差异度，运用步骤(5)筛选的共有差异显著代谢物，与已知品种的共有差异显著代谢物峰面积数据合并生成一个包含该待鉴定荔枝品种的差异代谢物heatmap图；

(8)同时进行聚类分析，与待鉴定品种最先聚集的已知品种判定为该待鉴定品种或其相近品种，从而获得鉴定。

2.根据权利要求1所述的运用广泛靶向代谢组学技术鉴别荔枝品种的方法，其特征是：步骤(1)中采集不同品种荔枝样品的成熟期果实，真空冷冻干燥后，研磨至粉末，选取粉末，采用有机溶剂提取，其中有机溶剂为甲醇、乙醇或丙酮，有机溶剂的体积百分含量为50～100％，粉末和有机溶剂的用量关系为0.08～0.15g：1mL，采用有机溶剂溶解后的粉末样品急速涡旋2～4次或超声1～2次，以提高提取率，其中超声时的功率为300～400W，频率为30～40kHz，将提取液经预处理，所述预处理包括过夜，离心后取上清液，过滤。

3.根据权利要求1所述的运用广泛靶向代谢组学技术鉴别荔枝品种的方法，其特征是：步骤(2)中所述超高效液相色谱和串联质谱仪为超高效液相色谱四级杆飞行时间质谱，其中色谱柱为C18，1.8μm，2.1mm×100mm；色谱条件为：流动相为水-乙腈，水相为含0.04％(质量百分含量)乙酸的超纯水，有机相为含0.04％(质量百分含量)乙酸的乙腈；梯度洗脱的程序为：0min为水/乙腈，95:5V/V，11.0min为水/乙腈5:95，V/V，12.0min为水/乙腈，5:95，V/V，12.1min为水/乙腈，95:5，V/V，15.0min为水/乙腈，95:5，V/V；流速为0.4mL/min，柱温40℃，进样量2μL；质谱条件主要包括：电喷雾离子源温度500℃，质谱电压5500V，帘气25psi，碰撞诱导电离参数设置为高，在三重四级杆中，每个离子对是根据优化的去簇电压和碰撞能进行扫描检测。