[发明专利]一株高效拮抗禾谷镰刀菌的伯克霍尔德氏菌属MEL01的制备方法及其应用

说明书

本发明涉及一株高效拮抗禾谷镰刀菌的伯克霍尔德氏菌属MEL01的制备方法及其应用，属于微生物技术领域。本发明采用在伯克霍尔德氏菌属MEL01摇瓶培养2d后静置培养3d，或摇瓶培养2d后继续摇瓶培养3天，每天加入禾谷镰刀菌菌丝，连续加入3次，利用该发酵方法得到的上清液对禾谷镰刀菌菌丝的抑制活性显著提高，在小麦扬花初期使用，可显著降低病情指数和DON的合成，本方法简单易操作，且能显著的提高伯克霍尔德氏菌属MEL01(Burkholderiasp.)发酵上清液的抑菌活性。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株高效拮抗禾谷镰刀菌的伯克霍尔德氏菌属MEL01的制备方法及其应用。

背景技术

禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)是一种可以引起小麦、大麦、水稻和玉米等多种禾本科作物发生赤霉病的重要病原菌之一。会使作物的穗部患病，籽粒皱缩，从而降低作物产量。更重要地是，禾谷镰刀菌在侵染作物的过程中，会产生有毒的代谢产物，脱氧雪腐镰刀烯醇毒素(deoxynivalanol，DON)，其性质稳定，耐热、耐压、耐弱酸、耐储藏，一般的食品加工过程不能破坏其结构，加碱或高压处理才可破坏部分毒素。当人摄食被DON污染的谷物制成的食品后可能会引起呕吐、腹泻、头疼、头晕等以消化系统和神经系统为主要症状的中毒症。 2015年国际食品法典委员会(CAC)首次颁布了DON限量标准，规定未加工的谷物中DON限量为2000μg/kg，谷物制品中限量为1000μg/kg，婴幼儿谷物食品中限量为200μg/kg。目前，防治赤霉病的手段，大多使用的是化学药剂防治，但是化学药剂会对人类的身体健康和环境造成严重的危害，还会引起禾谷镰刀菌的抗性发展。利用微生物实现生物防治具有高效低毒、安全环保等多种优势，现已逐步成为植物病害防治新的有效途径之一。

迄今为止，已有一些伯克霍尔德氏菌属对植物病害防治方面的研究。2010 年，任嘉红等人发现吡咯伯克霍尔德氏菌属JK-SH007对杨树溃疡病3种主要病原菌拟茎点霉(Phomopsismacrospore)、金黄壳囊孢菌(Cytosporachrysosperma)、七叶树壳梭孢菌(Fusicoccumaesculi)抑制作用较强，能有效防治杨树溃疡病。 2016年，毕可可等人发现一株伯克霍尔德氏菌属对油菜菌核病病原菌 (Sclerotiniasclerotiorum)、黑松叶斑病病原菌(Pestalotiopsissp.)、香蕉枯萎病病原菌(Fusariumoxysporumf.sp.cubense)、白蝴蝶炭疽病病原菌(Colletotrichumsp.) 和美人蕉瘟病病原菌(Pyriculariacannaecolahashioka)等植物病原真菌均有明显的抑制作用。

但鲜有报道伯克霍尔德氏菌属可以抑制禾谷镰刀菌。张志斌等报道一株东乡野生稻内生细菌唐菖蒲伯克霍尔德菌Fse32以及建仁等报道一种松树内生细菌新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05可抑制小麦赤霉病菌。但是，关于提高伯克霍尔德氏菌属抑制禾谷镰刀菌活性，以及提高伯克霍尔德氏菌属抑菌活性的发酵方法没有相关研究报道。且本研究发现，在一般的摇瓶发酵条件下，伯克霍尔德氏菌属发酵液不能抑制禾谷镰刀菌。

因此，本发明提供一株来源于湖北钟祥磷矿镇稻麦轮作区田间土壤中的天然生防菌伯克霍尔德氏菌属(Burkholderiasp.)MEL01，在防治麦类赤霉病中应用及培养方法。该申请中简单、高效的发酵培养方法可以显著提高伯克霍尔德氏菌属的抑菌活性。

发明内容

针对现有技术的不足，本申请的目的在于提供一株高效拮抗禾谷镰刀菌的伯克霍尔德氏菌属的制备方法及其应用，该发酵方法可以显著提高伯克霍尔德氏菌属(Burkholderiasp.)MEL01对禾谷镰刀菌的抑制活性，并可抑制其合成DON毒素。

经过发明人不懈努力和大量试验，最终获得了一种高效拮抗禾谷镰刀菌的伯克霍尔德氏菌属MEL01的简单制备方法，该方法包括如下步骤：

(1)从平板上挑取MEL01单菌落，接入无菌的LB液体培养基中，在28℃、 180r/min的条件下，培养24h，进行活化；