[发明专利]一种脂肪干细胞诱导分化成软骨细胞的方法

说明书

本发明提供一种脂肪干细胞诱导分化成软骨细胞的方法，所述方法，包括制备脂肪干细胞‑海藻酸钠悬液、制备脂肪干细胞‑海藻酸钙微珠、诱导培养。本发明所述脂肪干细胞诱导分化成软骨细胞的方法，利用含有PRP和转化生长因子‑β超家族成员(TGF‑β1、IGF‑1、BMP‑6)的不完全成软骨诱导培养液，联合使用PRP、转化生长因子‑β超家族成员，具有协同作用，能够上调Sox‑9基因表达，抑制诱导后脂肪干细胞向肥大表型分化，促进细胞增殖及提高诱导分化效率。采用本发明所述方法诱导分化13‑15天得到的软骨细胞的增殖活力是对照组A的3.4倍，是实验组B的2.2倍，是实验组C的1.95倍。

技术领域

本发明涉及一种脂肪干细胞诱导分化成软骨细胞的方法，属于干细胞技术领域。

背景技术

关节软骨缺损引起的病变在临床上较为常见，软骨创伤极难修复，因为软骨组织中没有血管和神经，其特点决定软骨不可再生。传统的治疗方法如关节冲洗、微裂缝、镶嵌成形术等，短期内可改善患者的临床症状，长期疗效不理想；关节假体置换可消除关节疼痛并恢复功能，但价格昂贵且并发症多；自体或异体软骨细胞提取困难，细胞数量少，增殖能力有限，限制了其临床应用，而软骨组织工程的发展为解决这些难题提供了新的方法。

软骨组织工程是将种子细胞接种到合适的生物支架材料形成复合物，在体外诱导后或者直接植入关节软骨缺损处，实现组织结构和功能的再生。种子细胞选择是修复或替换受损组织的关键。至今研究较多的是间充质干细胞，特别是骨髓间充质干细胞(BMSCs)是常用的种子细胞，但BMSCs需要从骨腔中取材，提取难度大，细胞来源有限，向成骨细胞分化效率低，其广泛应用受到一定的限制。Zuk（2001年）等从吸脂术获取的人类脂肪组织中首次分离得到了脂肪源干细胞(adipose derived mesenchymal cells，ASCs)。相比较于BMSCs，ASCs具有不受伦理限制、取材方便、来源充足、免疫原性低且增殖修复能力强等诸多优势，不同条件下可诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、表皮细胞等。因此，ASCs有望成为软骨组织工程最理想的种子细胞来源。

随着对ASCs研究的不断深入，人们一直在寻找ASCs诱导分化成软骨细胞的生物支架材料。目前常用的支架材料包括人工合成高分子聚合物和天然材料两大类，研究表明采用高分子合成材料构建的纤维网状骨架，具有促进ASCs向软骨细胞方向分化的作用，但是这些高分子材料生物相容性差，降解较慢，植入关节处会引起炎症反应。近期，有学者提出采用天然纤维胶水材料或海藻酸钙凝胶等一些天然材料作为支架材料，生物相容性好、安全性高、可塑性强、体内可降解，研究表明这种材料可以促进ASCs吸附于骨架表面，并且诱导ASCs分化成软骨细胞。亦有研究表明，不使用支架材料，直接往关节腔内注射ASCs，但细胞体外扩增培养以及将修复组织整合存在一定的难度。

脂肪干细胞成软骨分化多采用高密度三维培养方法，包括微球法、微滴法和支架法。微球法即利用ADSCs在特定培养条件自发形成小聚集体的特点，将ADSCs离心于离心管管底，形成细胞微球，加入诱导培养基成软骨细胞诱导，可以形成一定的软骨组织，但数量很少。微滴法即在培养基中调整细胞在较高密度，以高密度细胞滴的形式培养在孔板中，使其在37 ℃下黏附2 h，待细胞贴壁微滴较为稳固时加入软骨诱导培养基诱导培养，此种方法可以将脂肪干细胞诱导成为软骨细胞。支架法即将细胞高密度混悬于天然提取或人工合成的生物材料支架中，置于软骨诱导培养基中进行体外三维培养，将脂肪干细胞诱导成为软骨细胞，生物材料的选择是关键。

微球法和微滴法培养脂肪干细胞诱导分化成软骨，虽然简单方便，不需要特定的生物材料，但在培养过程中细胞聚集生长，易出现营养不足的缺陷，导致细胞增殖慢和向成骨细胞分化效率低，得到的软骨细胞数量很少，无法大规模应用于临床治疗；其次，软骨诱导培养基的选择是能否成功诱导成软骨的关键，现有的微球法、微滴法及支架法，多采用单一因子成软骨诱导培养基培养脂肪干细胞，在上调软骨特异性细胞外基质表达的同时，也上调了Runx2等软骨肥大标志物的表达，使形成的新生软骨被成骨细胞取代，软骨细胞的标记性基因的表达降低，且细胞增殖能力弱。