[发明专利]用于促进被引剂进入细胞的体外或离体方法

说明书

用于促进被引剂进入细胞的体外或离体方法，该被引剂为核酸或核酸类似物，该方法包括在聚六亚甲基双胍(PHMB)的存在下在盐的存在下将细胞暴露于该核酸或该核酸类似物的步骤，其中该核酸或该核酸类似物和该PHMB是纳米颗粒形式的复合物的形式；其中该被引剂包括多肽、肽、小分子药物、生物活性试剂或细胞成像探针/造影剂。

本申请是分案申请，其原申请的国际申请号为PCT/GB2012/052526，国际申请日是2012年10月11日，中国国家申请号为201280050149.X，进入中国的日期为2014年04月11日，发明名称为“方法”。

本发明涉及用于促进试剂(agent)(例如核酸)进入细胞的方法和反应试剂(reagent)的领域。

核酸和其类似物在基础研究以及预防性和治疗性干预中有许多应用。然而，原核和真核细胞对于核酸/类似物通常是不可渗透的。通常核酸/类似物的摄取需要病毒或非病毒递送载体，以激发它们的潜能(potential)。为了进行得有效，递送载体/核酸或类似物的组合或复合必须克服许多挑战，例如细胞外降解、细胞膜屏障的穿透(cell membranebarrier penetration) 和胞内释放，同时使细胞毒性和抗原性最小化。许多原本很有用的多肽(例如蛋白质、肽)和其它生物活性分子也是细胞不可渗透的。例如许多化合物的活性在生化分析中比在细胞分析或活体内的活性要高。细胞活性的下降被认为是主要是由于向细胞内的递送不良。

脂质转染胺(lipofectamine)是广泛使用的用于促进试剂(例如核酸) 进入细胞的试剂的实例。然而，脂质转染胺被认为对特别是哺乳动物细胞有毒性作用，这可以例如使体外实验难以评价且活体内实验难以执行。

其它被提出的促入剂(entry-promoting agent)描述在例如WO 2009/015143(Biodegradable cationic polymer gene transfer compositions and methods ofuse)；WO 02/22174(作为生物相容性基因递送剂的阳离子脂质聚合物(cationiclipopolymer as biocompatible gene delivery agent))； WO2010/086406(非病毒转染剂)；US 5,958,894(两亲性双胍衍生物)中。

需要替代性的促进进入的试剂(促入剂)，用于例如核酸和其它物质，当活性受限于较差的细胞进入时。本发明识别出了促进进入的试剂和方法。这样的促进进入的试剂和方法被认为是有益于例如为特别是真核细胞提供良好的进入促进、较弱的抗原性、低成本和/或低毒性。这样的促进进入的试剂和方法可能例如在诸如以下等领域是有用的：核酸/类似物的转染，例如功能的研究；稳定细胞系的产生；基因沉默；和DNA疫苗。如本领域普通技术人员将容易理解的，这样的促入剂和方法可能在相关的RNA干扰(RNAi)或其它反义技术中是有用的。递送反应试剂或药物至细胞中的的挑战并不仅仅局限于核酸。蛋白质和肽通常也很难进入细胞，促入技术也是有用的。而且，许多被描述为小于1000克/摩尔的小分子也难以进入细胞，而通过改进的细胞递送技术将会提高它们作为试剂或药物的效用。

PHMB(聚六亚甲基双胍)是已知的作为安全有效的杀生物剂(biocidal agent)，并被用作消毒剂(sanitiser)和防腐剂：US7897553、US 4758595、 US2008261841；US20040009144。本申请的发明者已经出人意料地发现 PHMB和相关的分子是有用的促入剂。出人意料地观察到PHMB(举例) 本身进入多种细胞，包括细菌、真菌和哺乳动物细胞。更出人意料地是， PHMB(举例)能够与多种分子形成纳米颗粒并将这些分子递送至这些细胞内。最后发现所递送的从核酸至小分子的分子在细胞内是能发挥作用的。

在本说明书中明显的先前出版的文献的列出或论述不一定被认为是承认该文献是现有技术状态的部分或是公知常识。