[发明专利]花生毛状根株系在提高花生耐低氮、耐高盐能力中的应用

说明书

本发明提出一种花生毛状根株系在提高花生耐低氮、耐高盐能力中的应用，属于植物基因工程技术领域。本发明的技术方案包括：通过从花生中克隆出AhCEP1基因，构建植物基因表达载体后，利用发根农杆菌介导的方法获得含花生AhCEP1基因的花生毛状根，并鉴定转基因花生毛状根中花生AhCEP1基因是否表达，并测定其表达量，然后筛选出转基因花生毛状根阳性株系。利用本发明提供的方法不仅能有效提高花生毛状根耐低氮、耐高盐的能力，还能提高在低氮、高盐胁迫环境下花生毛状根的含量，在花生抗胁迫领域具有十分广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，尤其涉及一种花生毛状根株系在提高花生耐低氮、耐高盐能力中的应用。

背景技术

花生是我国重要的油料作物，但随着社会发展和人民生活水平的不断提高，我国食用油产量严重不足，因此盐碱地的治理利用是解决目前我国耕地紧缺、缓解粮油争地矛盾的重要途径，低氮和高盐是目前盐碱地花生生长的两大主要危害。其中，氮素是花生生长必须的主要元素之一，氮素供应不足，花生的蛋白质、叶绿素和核酸合成受阻，导致花生植株矮小、叶面黄瘦、叶片光合强度降低，严重影响了花生产量。

目前，遗传转化途径是改良花生品种抗逆性，提高花生耐低氮、耐高盐的重要生物途径之一。同时已有研究表明C-terminally pepetides(CEPs)基因在植物的生长发育及其胁迫响应过程中起到非常重要且独特的作用，但研究主要集中在拟南芥和苜蓿中，对于花生CEP基因的研究甚少，因此开发出一种花生毛状根株系在提高花生耐低氮、耐高盐能力中的应用是解决我国耕地紧张、缓解粮油争地矛盾、大幅提高花生产量的有效解决方法。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的花生CEP基因在花生生长发育及胁迫应答方面研究甚少的技术问题，提出一种具有定向高效性、育种周期短的花生毛状根株系在提高花生耐低氮、耐高盐能力中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

花生毛状根株系在提高花生耐低氮、耐高盐能力中的应用，所述花生毛状根株系是通过以下方法得到的，具体步骤如下：

从花生cDNA中克隆出AhCEP1基因后，将所述AhCEP1基因连接到表达载体上，构建含AhCEP1基因的植物表达载体；

将含AhCEP1基因的植物表达载体转化至发根农杆菌，获得含AhCEP1基因的发根农杆菌；

利用含AhCEP1基因的发根农杆菌菌液侵染花生叶片，得到被含AhCEP1基因的发根农杆菌菌液侵染的花生叶片后，诱导其产生转基因花生毛状根，转入含有卡那霉素的MS固体培养基上培养；

鉴定所述转基因花生毛状根中AhCEP1基因是否表达后，测定所述转基因花生毛状根中AhCEP1基因的表达量，并筛选转基因花生毛状根阳性株系，即得花生毛状根株系。

在上述方法中，提取花生RNA的方法为Trizol抽提法或根据RNA提取试剂盒说明提取得到；所述反转录过程是使用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix反转录试剂盒说明制得的；利用含花生分泌肽基因的发根农杆菌菌液侵染叶片前要对花生叶片进行预处理，即在叶片上加2-3处的划痕，目的是保证发根农杆菌菌液能进入叶片内完成诱导过程；

此外还需要说明的是，转基因花生毛状根中AhCEP1基因的表达量是通过qRT或RT-PCR法测得的，分别设置了对照组和实验组。其中，对照组为转化有空载体的毛状根(即CEP1基因的本底表达水平)。只要实验组的表达量高于这个本底水平即为过表达株系。因为不同基因转化植物后表达水平会有差异，所以未做具体的数值限定。进行遗传转化实验会获得多个过表达株系，进一步选择表达量最高的转基因株系进行后期胁迫实验。

作为优选，构建所述植物表达载体的方法为酶切连接法或gateway系统构建法。