[发明专利]一种肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞上PD-L1表达的免疫荧光检测方法

说明书

本发明公开了一种肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞上PD‑L1表达的免疫荧光检测方法包括8%PFA，0.4%PFA，0.3%TritonX‑100，10%山羊血清，抗人PD‑L1、大鼠抗CD45组成的一抗混悬液100μl，荧光标记的羊抗兔、荧光标记的羊抗大鼠组成的二抗混悬液100μL，DAPI封片剂；检测方法包括外周血采集、外周血样预处理、样本分离、甲醇固定、贴膜、组化笔画圈、细胞固定、细胞穿透、封闭、一抗孵育、二抗孵育及核染色、封片及检测。本发明提供的检测方法，不用穿刺活检获取组织标本即可检测到晚期或复发肝细胞癌患者PD‑L1表达情况，利用微创技术，能够实现实时动态检测。

技术领域

本发明提供了一种检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1表达的试剂盒及检测方法，对晚期肝细胞癌患者应用PD-1抑制剂免疫治疗提供实时动态临床指导，属于分子生物学技术领域。

背景技术

肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，死亡率高，在恶性肿瘤死亡顺位中仅次于胃、食道而居第三位；在部分地区的农村中居第二位，仅次于胃癌。我国每年死于肝癌约11万人，占全世界肝癌死亡人数的45％，肝癌平均患病年龄44岁。肝癌病理分型为肝细胞癌、胆管细胞癌、混合型肝癌，其中肝细胞癌占70-80%，其恶性程度高，发展迅速，若治疗不及时或治疗方案选择不当，平均生存时间为半年左右。肝细胞癌早期无症状，一旦出现明显症状，约有1/3已属晚期，患者会感到肝区胀痛，尤其饭后为甚，厌食，肝大，右上腹肿块，不明原因的消瘦、腹胀、腹泻、间断性发热、乏力、食欲减退等，严重影响人类寿命及生活质量。

目前随着分子生物学的发展，中晚期肝细胞癌的免疫治疗逐渐兴起，初步的临床试验也取得了较好的疗效，目前多项III期临床试验正在开展，以PD-1/PD-L1为免疫靶点的免疫疗法为肝细胞癌治疗带来了新的曙光。研究发现，免疫抑制与免疫逃逸和肿瘤细胞PD-L1的过表达密切相关，肿瘤细胞可通过其表面的PD-L1与免疫细胞T细胞表面的PD-1结合，传导抑制性信号，使得T细胞不能识别肿瘤细胞和向肿瘤细胞发出攻击信号，导致了肿瘤细胞免疫逃逸。PD-1或PD-L1免疫制剂的疗效多与肿瘤组织中PD-L1的免疫荧光表达水平有关，提示PD-L1表达水平可能是预测PD-1免疫治疗疗效的生物标志物；还有研究表明肝细胞癌组织中PD-L1的高表达与肿瘤侵袭性呈正相关。但晚期或复发肝细胞癌患者无法实时或反复穿刺获取组织标本、进而不能评估患者PD-L1实时动态状态。

循环肿瘤细胞（Circulating tumor cell，CTC）是从实体肿瘤脱落进入外周血液循环的肿瘤细胞，自1989年被发现以来，目前已有多种方法用于外周血循环肿瘤细胞的检测。近期研究表明，其检测对于评估肿瘤患者尤其是晚期肿瘤患者的预后以及选择合适的个体化治疗具有重要的临床意义。因CTC检测具有微创、实时检测等特点，被称为肿瘤的“液态活检”。

免疫荧光分析技术即将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来用以研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发出的荧光可在荧光显微镜下检出，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光(黄绿色或橘红色)，可以看见荧光所在的细胞或组织，利用定量技术测定含量，从而对抗原进行细胞定性和定位分析。

经文献检索发现，目前乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、非小细胞肺癌应用不同的检测方法对循环肿瘤细胞(CTC)PD-L1表达检测有少量报道，但肝细胞癌循环肿瘤细胞PD-L1的检测国内外均未见报道。因此，检测循环肿瘤细胞(CTC)PD-L1表达情况对肝细胞癌患者预后及免疫治疗疗效评估具有重要价值。

发明内容

针对现有技术中晚期或复发肝细胞癌患者无法实时或反复穿刺获取组织标本、进而不能评估患者PD-L1实时动态状态的缺点，本发明提供了一种检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1表达的试剂盒及检测方法：利用膜过滤装置分离获得晚期肝细胞癌患者外周血中的循环肿瘤细胞（CTC），进一步运用免疫荧光技术检测CTC中PD-L1表达情况。

本发明通过以下技术方案实现：