[发明专利]一种去除水中阴离子的自絮凝基因工程菌构建方法及其应用

权利要求书

1.一种去除水中阴离子的方法，其特征在于，所述的阴离子为硝酸根、磷酸根、硫酸根、亚硫酸根；采用吸附自絮凝工程菌进行自絮凝、沉降的方法，菌种自生产的蛋白吸附目标阴离子，自絮凝沉降到底部，达到通过微生物自动去除水中阴离子污染物的目的；

其中吸附自絮凝工程菌的构建方法步骤包括：克隆高活性的辣木种子阳离子蛋白基因MO2.1和酿酒酵母自絮凝蛋白基因FLO5，构建含有两段基因的共表达质粒，转化大肠杆菌感受态细胞，诱导自絮凝蛋白与正电荷凝集蛋白共表达的基因工程菌；

所述自絮凝基因为酿酒酵母FLO5基因；

所述正电荷凝集蛋白基因为辣木种子蛋白MO2.1基因；

构建方法具体步骤为：

（1）合成辣木种子蛋白MO2.1基因，序列见SEQ ID NO 2，进行PCR扩增，利用BamHI和HindIII分别将MO2.1基因和质粒PETduet-1双酶切，质粒PETduet-1序列见SEQ ID NO 3，把PCR片段和质粒PETduet-1进行连接构建得到带有MO2.1的质粒PETduet-1-MO2.1，序列见SEQ ID NO 4;

所述PCR扩增条件为：

引物M1：YAK0062-1：5'-GACACGGATCCGCAGGGACCTGGTCGGCAGCCGG-3'

引物M2：YAK0062-8：5'-GTGTCAAGCTTTTAGGTGCTAGGTATATTGGATGCCAC-3'

首先，94℃预变性 2 min，之后，96℃，30秒;55°C，30秒;72°C，1分钟;共进行30个周期，最后，72℃延伸 15 min；

（2）合成酿酒酵母自絮凝蛋白FLO5基因并PCR扩增，酿酒酵母自絮凝蛋白FLO5基因序列见SEQ ID NO 1，然后利用一步法定向克隆无缝克隆试剂盒把PCR片段与步骤（1）的质粒PETduet-1-MO2.1进行连接，得到自絮凝蛋白FLO5与正电荷凝集蛋白MO2.1表达质粒PETduet-1-MO2.1-FLO5，序列见SEQ ID NO5，检测正确后转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞，得到自絮凝蛋白与正电荷凝集蛋白共表达基因工程菌株E.coli BL21（DE3）/ PETduet-1-MO2.1-FLO5；

步骤（2）PCR扩增：

引物F1：YAK0063A1-1：5'-GACACGGATCCAGATCTCATGACAATTGCACACCACTG-3'

引物F2：YAK0063C-34：5'-GTGTCAAGCTTCTCGAGTTAAATAATT-3'

首先，94℃预变性 4 min，之后，94℃，1 min;58°C，20秒;72°C，3分钟;共进行30个周期，最后，72℃延伸 8 min。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括菌株的优化培养的方法，步骤包括：将构建的吸附自絮凝工程菌进行扩大培养，再进行条件优化，得到最优的去除条件；

所述扩大培养包括如下：

（1）将所述吸附自絮凝工程菌接入含100mg/L氨苄青霉素的LB斜面培养基

37℃培养10-20h；其中LB斜面培养配方为：酵母粉5g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 5g/L，琼脂 20g/L，PH7.0，121℃灭菌30min；

（2）500ml三角瓶装LB液体培养基50ml，加入100mg/L的氨苄青霉素，接步

骤（1）斜面菌种于种子培养基37℃、200r/min培养18h；

其中所述液体LB培养基包括为：酵母粉 5g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 5g/L，PH7.0，121℃灭菌30min；

所述条件优化培养方法为：将上述培养后的菌液以1:50-1:100的体积比例加入到新的含有氨苄青霉素的液体LB中进行再次培养，在37℃、200 rpm扩培1.5-2h后使其OD600位于0.4~0.6；

在上述培养后的菌液中加入终浓度为0.1 -1mM的IPTG，在20-25℃下、200 rpm扩培5-12h。