[发明专利]从植物中大量生产碳酸酐酶的方法

说明书

本发明涉及用于从植物中生产及分离纯化碳酸酐酶的重组载体的设计及利用该重组蛋白质的纤维素结合模块3域的纤维素珠(cellulose bead)结合性质来分离纯化包含从植物中生产的碳酸酐酶的重组蛋白质的方法和借助利用纤维素结合模块3来坚固地固定于纤维素珠的表面的状态的碳酸酐酶诱导二氧化碳的水合反应的方法。

技术领域

本申请将2019年3月22日申请的韩国专利申请第10-2019-0032749号作为优先权来主张，上述说明书全文为本申请的参考文献。本发明涉及从植物中大量生产碳酸酐酶以及利用其来应用于二氧化碳的水合反应的方法。

背景技术

碳酸酐酶(Carbonic anhydrase)使二氧化碳水合于水中或从重碳酸盐离子中执行脱水反应。碳酸酐酶在活性部位具有锌(Zinc)金属离子，从而被称之为金属化酶。碳酸酐酶可应用于特异性地捕集CO₂。当将碳酸酐酶同时使用于甲基二乙醇胺(MDEA)时，呈现比单独使用甲基二乙醇胺时更高的CO₂捕集活性。并且，对回收捕集于甲基二乙醇胺(MEDA)溶液的CO₂有效。碳酸酐酶可从包含CO₂的混合气体中单纯地捕集CO₂来仅回收CO₂。当前，正在开发利用作为胺系列的化合物的甲基二乙醇胺(MDEA，methyl diethanol amine)或Ni-MOF-74之类的膜来从排放气体中捕集CO₂或通过加压摆动吸附(PSA，pressurization swingingadsorption)工艺从包含CO₂的混合气体中单纯地仅纯化CO₂的技术。为了应用于CO₂的捕集，必须要以低费用大量生产碳酸酐酶，并将其纯化来使用。当在甲基二乙醇胺(MEDA)溶液中包含碳酸酐酶来使用时，利用大肠杆菌来生产DvCA碳酸酐酶(来源于普通脱硫弧菌(Desulfovibrio vulgaris)的CAH)，并不进行分离纯化，而直接使用包含碳酸酐酶的大肠杆菌。

分子生物学和遗传工学技术的飞速发展还适用于植物领域，从而不断努力从植物体中生产有用生理活性物质。当从植物中生产有用物质时，具有如下优点：可大大减少生产成本，可从根本上排除在以往的动物细胞或微生物中合成来分离纯化蛋白质的方法中有可能产生的病毒、癌症基因、肠毒素之类的多种污染源，在商品化步骤中也与动物细胞或微生物不同，可利用种子来长期进行保管及管理。并且，当相应的有用物质的需求急增时，在大量生产所需的设备技术或费用方面，比现有的动物细胞系统绝对有利，因而可根据在最短期间内提高的需求进行供给，这也是优点。

但是，即使有这种优点，其最大缺点在于，当从植物细胞中生产蛋白质时，表达与包含动物细胞的其他宿主相比相对低的蛋白质，并难以进行分离纯化。对其有很多研究，作为多种方法，试图在植物细胞中增加蛋白质表达量，并有效分离纯化蛋白质。当利用植物时，有如下方法：利用转化体来生产蛋白质的方法、利用由农杆菌介导的转化来在植物中过度诱导蛋白质的表达，并由此生产蛋白质的方法等。例如，在韩国公开专利号第10-2018-0084680号中公开有用于植物细胞中表达目的蛋白质的重组载体，在韩国公开号第10-2017-0131207号中公开有利用RbcS融合蛋白质来从植物中高表达目的蛋白质的方法及利用目的蛋白质表达植物体的医疗用蛋白质的口服给药用组合物的制备方法。当利用转化体时，应用利用整个植物来在叶子或种子之类的特定组织中生产蛋白质的方法、从转化体中诱导细胞株(cell line)来生产蛋白质的方法。虽然通过由农杆菌介导的转化的方法迅速且表达水平也高，但相比于包括培养农杆菌并通过真空进行浸润的步骤等利用转化植物，工序更复杂。

在本发明中，为了在植物中容易分离纯化碳酸酐酶而锐意努力，其结果，确认到当将纤维素结合模块3(CBM3)、小泛素相关修饰物(SUMO)及M域融合于作为碳酸酐酶的GcCAHα3或SazCA时，可在植物中容易生产碳酸酐酶，并利用其来进行分离纯化，并且，利用固定于纤维素珠的表面的碳酸酐酶应用于二氧化碳的水合反应来进行确认，从而完成本发明。

发明内容