[发明专利]一种促进皮肤组织损伤后修复用工程化外泌体的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种促进皮肤组织损伤后修复用工程化外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）目标基因表达载体的构建；获取或构建外泌体胞浆运送辅助质粒、促外泌体分泌质粒、目标基因mRNA包装质粒；所述的目标基因表达载体为Ⅰ型胶原蛋白基因表达载体、Ⅱ型胶原蛋白基因表达载体、Ⅲ型胶原蛋白基因表达载体和生长因子基因表达载体的一种或几种；所述的目标基因为胶原蛋白基因和/或各种促皮肤损伤修复相关生长因子基因；

（2）由目标基因表达载体、胞浆外泌体运送辅助质粒、促外泌体分泌质粒和目标基因mRNA包装质粒组成的混合质粒共转染HEK293F细胞或间充质干细胞并培养；

（3）促进皮肤组织损伤后修复用工程化外泌体的分离：收集上述转染后HEK293F细胞或间充质干细胞的培养液，过滤得到培养液中的外泌体。

2.根据权利要求1所述的一种促进皮肤组织损伤后修复用工程化外泌体的制备方法，其特征在于，所述的Ⅰ型胶原蛋白基因表达载体为pGmH1:pcDNA3.1-Ⅰ型胶原蛋白基因-C/Dbox-pAbGH; pGmH2:Ⅱ型胶原蛋白基因表达载体为pcDNA3.1-Ⅱ型胶原蛋白基因-C/Dbox-pAbGH;pGmH3:Ⅲ型胶原蛋白基因表达载体为pcDNA3.1-Ⅲ型胶原蛋白基因-C/Dbox-pAbGH，各种促皮肤损伤修复相关生长因子基因表达载体为pGmH4:pcDNA3.1-生长因子基因-C/Dbox-pAbGH；所述的外泌体胞浆运送辅助质粒为pGmH5:pcDNA3.1- Cx43S368A-pAbGH；所述的促外泌体分泌质粒为pGmH7:pcDNA3.1-STEAP3-p2A-SDC4- p2A-NadB-pAbGH；所述的目标基因mRNA包装质粒为pGmH6:pcDNA3.1-CD63-L7Ae-pAbG。

3.根据权利要求2所述的一种促进皮肤组织损伤后修复用工程化外泌体的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，目标基因表达载体在构建时，直接合成目标基因且在目标基因3’UTR区设置一段核酸序列C/Dbox并一起插入pcDNA3.1载体中。

4.根据权利要求1所述的一种促进皮肤组织损伤后修复用工程化外泌体的制备方法，其特征在于，在步骤（3）的具体过程为：收集HEK293F细胞或间充质干细胞培养液，在离心力600-700g条件下、0-4℃离心15-20分钟，取上清在离心力11000g-12000g条件下、0-4℃离心25-30分钟，再用0.22µm滤膜过滤，取滤液在离心力150000-170000g条件下、0-4℃离心2-4小时，用4℃的PBS溶液洗涤沉淀，得到促进皮肤组织修复的工程化外泌体。

5.根据权利要求1或2所述的一种促进皮肤组织损伤后修复用工程化外泌体的制备方法，其特征在于，在步骤（2）中，由目标基因表达载体、胞浆外泌体运送辅助质粒、促外泌体分泌质粒和目标基因mRNA包装质粒共转染HEK293F细胞或间充质干细胞后，37℃恒温培养并通入5%的CO₂、4-7%的氧气，经过50-55h后，得到HEK293F细胞或间充质干细胞的培养液；共转染时，由目标基因表达载体、胞浆外泌体运送辅助质粒、促外泌体分泌质粒和目标基因mRNA包装质粒的摩尔质量比为:1-2.5:0.5-1：0.8-1.2：0.5-1。