[发明专利]活体采集牛卵母细胞进行体外受精和胚胎培养的方法

权利要求书

1.牛体外受精胚胎培养的方法，其包括如下步骤：

(1)卵母细胞的采集和体外成熟

a)活体采集：取牛活体采卵来源的卵泡液，在体视显微镜下捡出至少含3层卵丘细胞包裹的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)，放入包含HEPES的运输培养液中38.8℃、无二氧化碳供应、24h内运回实验室；

b)将以上离体采集或者活体采集所得COCs在卵母细胞成熟培养液中洗涤1次，再转移到新的成熟培养液中培养22-24h，培养条件为38.8℃、5.5-6.5％CO2、饱和湿度；

(2)体外受精

将成熟的COCs在受精培养液中洗涤1次，再转移到受精培养液中，放入培养箱中，备用；

从液氮中取一支冻精细管，37℃水浴解冻；无菌操作剪开细管两端，使精液注入盛有精液制备培养液的15mL离心管中，328×g离心2次，每次5min，离心后弃上清；将300μL精液制备培养液加入上述离心管，重悬精子沉淀，取适当的精子悬液进行精子计数；

将计算好体积的精子悬液加入盛有卵母细胞的受精培养液滴中，并将培养盘放入培养箱，使精卵共孵育16-20h，培养条件为38.8℃、5.5-6.5％CO2、饱和湿度；

(3)胚胎体外培养及保存

体外受精操作完毕后，将胚胎周围的颗粒细胞用剥卵针去除干净，放入胚胎培养液中培养，此时记为胚胎培养的第1天，培养条件为38.8℃、6％O2、88％N2、饱和湿度，第3天记录卵裂率；第7天记录囊胚率，至第9天时统计囊胚孵化率(其为孵化囊胚数除以囊胚数所得百分数)，并进行质量鉴定；

将可用胚胎在保存液中洗涤3次，在平衡液中平衡10min后转移入冷冻液，按5段装液法装入胚胎，做好标记，再放入程序降温仪中按照0.5℃/min的速度降至-35℃后，将胚胎细管迅速取出，置入液氮中冷冻保存。

2.根据权利要求1的方法，其中步骤(1)之(b)中，所述成熟培养液是添加了100mL/LFBS、10μg/mL FSH、10μg/mL LH、1μg/mL E2、20ng/mL EGF的BY基础培养液。

3.根据权利要求1的方法，其中步骤(1)之(a)中，所述运输培养液中包含：甘氨酸50.0mg/L、L-丙氨酸25.0mg/L、L-精氨酸盐酸盐70.0mg/L、L-天冬氨酸30.0mg/L、L-胱氨酸二盐酸盐26.0mg/L、L-谷氨酸75.0mg/L、L-谷氨酰胺100.0mg/L、L-组氨酸盐酸盐一水合物21.88mg/L、L-羟基脯氨酸10.0mg/L、L-异亮氨酸40.0mg/L、L-亮氨酸60.0mg/L、L-赖氨酸盐酸盐70.0mg/L、L-甲硫氨酸15.0mg/L、L-苯丙氨酸25.0mg/L、L-脯氨酸40.0mg/L、L-丝氨酸25.0mg/L、L-苏氨酸30.0mg/L、L-色氨酸10.0mg/L、L-酪氨酸二钠盐二水合物58.0mg/L、L-缬氨酸25.0mg/L、抗坏血酸0.05mg/L、生物素0.01mg/L、氯化胆碱0.5mg/L、D-泛酸钙0.01mg/L、叶酸0.01mg/L、甲萘醌0.01mg/L、烟酰胺0.025mg/L、烟酸0.025mg/L、对氨基苯甲酸0.05mg/L、盐酸吡哆醛0.025mg/L、盐酸吡哆醇0.025mg/L、核黄素0.01mg/L、盐酸硫胺素0.01mg/L、维生素A醋酸酯0.1mg/L、维生素D2即骨化醇0.1mg/L、α-生育酚磷酸钠盐0.01mg/L、肌醇0.05mg/L、无水氯化钙200.0mg/L、硝酸铁九水合物0.7mg/L、无水硫酸镁97.67mg/L、氯化钾400.0mg/L、氯化钠6800.0mg/L、磷酸二氢钠一水合物140.0mg/L、硫酸腺嘌呤10.0mg/L、5'-磷酸腺苷0.2mg/L、三磷酸腺苷1.0mg/L、胆固醇0.2mg/L、葡萄糖1000.0mg/L、脱氧核糖0.5mg/L、还原型谷胱甘肽0.05mg/L、盐酸鸟嘌呤0.3mg/L、次黄嘌呤钠0.354mg/L、酚红20.0mg/L、核糖0.5mg/L、醋酸钠50.0mg/L、胸腺嘧啶0.3mg/L、吐温80为20.0mg/L、尿嘧啶0.3mg/L、黄嘌呤钠0.3mg/L，以及0.01IU/mL的FSH、0.01IU/mL的LH、1μg/mL的E₂，50ng/mL的EGF、100ng/mL的IGF、10％庆大霉素、55μg/mL丙酮酸钠、1.2mM/L半胱氨酸、3mg/mL的BSA、10mM/L的HEPES。