[发明专利]卵泡颗粒细胞近红外荧光探针Nirova-2及其制备方法和应用

说明书

本发明属于医学影像造影剂技术领域，具体为卵泡颗粒细胞近红外荧光探针Nirova‑2及其制备方法和应用。本发明荧光探针为有机小分子近红外染料IR800 CW与人促卵泡激素（FSH）耦合形成的荧光染料‑人促卵泡激素偶联复合体；该复合体使得荧光染料能够特异性的靶向卵巢中组成卵泡壁的颗粒细胞，实现对所有卵泡的近红外荧光标记。该荧光探针结合IR800 CW在近红外区荧光发射的特点与FSH对卵巢内卵泡颗粒细胞特异性靶向结合的性质，可作为卵巢中卵泡的近红外区荧光造影剂，从而对女性卵巢中卵泡数量及发育阶段进行精确有效的检测评估。

技术领域

本发明属于医学影像造影剂技术领域，具体涉及卵泡颗粒细胞近红外荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

目前针对患有不孕症的育龄或超龄女性，常需要进行对其进行卵巢内成熟与未成熟卵泡检测，目前实施手段为传统B型超声成像技术或经阴道超声成像技术。但该技术仅能观察到二级以上的卵泡（通常在600μm以上），受限于声波波长的局限，超声成像的最高分辨率为百微米级，因此对于更小的卵泡（如原始卵泡，直径仅若干微米）则无法进行检测，导致部分仅残留较小卵泡的患者失去可进一步治疗的希望。而荧光成像由于实时、非入侵性、高时空分辨率等优点，在生命科学领域被广泛应用，近年来其应用领域更推广至临床成像检测及诊断。相较于传统的可见区（400-700nm）的荧光，近红外区（700nm-1700nm）的荧光成像有更深的穿透深度，更低的生物自荧光背景干扰，能够实现更高质量的组织荧光成像。

近年来，多种在近红外区发射荧光的有机染料被设计合成，为近红外区生物组织荧光成像提供了宝贵的物质基础。例如2006年由美国国家食品与药物监督管理局（FDA）批准的近红外荧光染料吲哚菁绿（ICG）具有较大的摩尔消光系数，较高的荧光量子产率，较好的水溶性，较快的生物代谢速率，在蛋白标记，手术导航中得到了广泛应用。而后续发明的IR800 CW由于具有更红移的发射峰，更好的光稳定性以及自带马来酰亚胺活性酯基团，更适用于进行生物组织的近红外区荧光成像。到目前为止，还未报道利用IR800 CW与人促卵泡激素合成的探针对卵巢中卵泡颗粒细胞进行近红外区荧光标记。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备工艺简单、特异性高、光稳定性好的近红外区、卵巢内卵泡颗粒细胞靶向的荧光探针及其制备方法和应用。

本发明提供的泡颗粒细胞靶向的荧光探针，是由有机小分子近红外染料IR800 CW与人促卵泡激素（FSH）连接形成的荧光染料-人促卵泡激偶联素复合体，记为荧光探针Nirova-2；其化学结构式为：

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其中，FSH原料选自：重组人促卵泡激素α、重组人促卵泡激素β、重组人促卵泡激素、尿促卵泡激素、垂体提纯人促卵泡激素。

本发明所提出的近红外染料IR800 CW与人促卵泡激素合成的卵泡颗粒细胞近红外荧光探针探针的制备方法，具体步骤如下：

称取FSH，充分溶解于磷酸盐缓冲溶液为主的反应体系中，在还原剂还原下切断蛋白质亚基中的二硫键，释放游离巯基；称取IR800 CW溶于磷酸盐缓冲溶液为主的反应体系中，在温度4℃-37℃条件下加入处理后的FSH溶液，搅拌反应20-30h；提纯，除去未反应的IR800CW及过量的DTT。即得到近红外染料IR800 CW与人促卵泡激素合成的卵泡颗粒细胞近红外荧光探针探针（荧光探针Nirova-2）。

其中，FSH原料选自：重组人促卵泡激素α、重组人促卵泡激素β、重组人促卵泡激素、尿促卵泡激素、垂体提纯人促卵泡激素；

还原剂选自：二硫苏糖醇（DDT）、抗坏血酸、三（2-羧乙基）膦（TCEP）等常用硫醇类还原剂。

本发明中，为保证IR800 CW与FSH偶联的成功性，利用蛋白质二硫键还原剂二硫苏糖醇（DDT）等对FSH中的二硫键进行还原，获得其上自由的巯基，进而与IR800 CW上的马来酰亚胺酯进行偶联。