[发明专利]一种流感病毒相关宿主基因突变体的筛选方法

说明书

一种流感病毒相关宿主基因突变体的筛选方法，属于随机突变技术领域。为了筛选出与流感病毒相关的宿主基因，本发明提供了一种筛选方法：1)用CAG‑tTA质粒转染人肺癌细胞株，获得稳定表达且受四环素调控的转录激活因子的Tet‑off细胞株；将基因搜寻载体和有效表达转座酶的质粒共转染所述Tet‑off细胞株，获得全基因组肺上皮细胞基因突变文库；2)利用H1N1‑WSN流感病毒感染步骤1)获得的突变文库；3)提取步骤2)中获得的抗H1N1‑WSN流感病毒的细胞株基因组DNA，经Splinkette PCR，测序获得流感病毒相关宿主基因突变体。本发明可用于流感病毒相关宿主基因突变体的筛选。

技术领域

本发明涉及一种流感病毒相关宿主基因突变体的筛选方法，属于随机突变技术领域。

背景技术

季节性流感是一种急性呼吸道传染性疾病，是全人类严重的公共卫生问题；其特点包括易暴发、易播散、易演变、易感人群广、易季节流行以及发病率高。由于流感病毒突变性高以及病毒之间发生重组，现有的抗流感病毒药物和疫苗很难有效应对多变的流感病毒。同病毒蛋白相比，参与病毒感染和扩展的宿主因子不易发生变异，是干预病毒复制和抑制宿主反应的重要靶标。因此，筛选和鉴定抗流感病毒关键宿主因子可能是有效防控和治疗流感病毒的突破口。

近年来，很多方法都被用来筛选抗流感病毒相关宿主基因，包括基因芯片、microRNA芯片、高通量测序、小分子RNA干扰、CRISPR/Cas9筛选、化学诱变DNA和插入突变等技术。RNA干扰、cDNA文库、CRISPR/Cas9突变和芯片技术等需要提前获知靶基因的序列，这样会缩小基因筛选的范围，常会漏掉一些未知基因和非编码区；高通量测序和芯片技术所得到的基因与流感病毒感染间并不具备明确的因果关系，其中可能很多关键宿主基因只是某个时机一过性的上调或下调，这些静态的分析极有可能忽略这些基因；此外，基因芯片或测序技术所得到的数据庞大，有成千上万的基因表达发生差异，为后续的分析工作带来了巨大困难。因此，需要一种研究方法能够再现流感病毒感染细胞的动态过程，鉴定出控制流感病毒感染与其发生具有因果关系的关键宿主基因。

插入突变是利用已知的外源DNA插入序列作为标记，破坏基因的结构而导致突变，可以直接验证个别基因与所筛选性状之间关系，是一种理想的功能基因组学研究方法。

发明内容

为了筛选出与流感病毒相关的宿主基因，本发明提供了一种流感病毒相关宿主基因突变体的筛选方法，步骤如下：

1)建立随机基因突变文库：用CAG-tTA质粒转染人肺癌细胞株，获得稳定表达且受四环素调控的转录激活因子的Tet-off细胞株；将基因搜寻载体和有效表达转座酶的质粒，共转染所述Tet-off细胞株，获得全基因组肺上皮细胞基因突变文库；所述基因搜寻载体包含四环素反应元件、piggyBac转座子、新霉素抗性基因和质粒复制起点，所述四环素反应元件通过两段四环素反应元件拼接得到；所述有效表达转座酶的质粒为MPB；

2)筛选抗甲型流感病毒H1N1-WSN毒株的突变肺上皮细胞株：利用H1N1-WSN流感病毒感染步骤1)获得的全基因组肺上皮细胞基因突变文库，按照MOI＝5加入H1N1-WSN流感病毒，培养2周后挑取单个克隆，经筛选后得到抗H1N1-WSN流感病毒的细胞株；

3)流感病毒感染相关宿主基因的克隆：提取步骤2)中获得的抗H1N1-WSN流感病毒的细胞株基因组DNA，经Sau3A1限制性内切酶后连接接头DNA，然后进行Splinkette PCR，测序获得基因搜寻载体插入两端的DNA序列，即为流感病毒相关宿主基因突变体。

进一步地限定，步骤1)所述人肺癌细胞株为人肺癌细胞株A549。

进一步地限定，步骤1)所述基因搜寻载体的转染剂量为500ng/10⁵个细胞，所述有效表达转座酶的质粒的转染剂量为125ng/10⁵个细胞。