[发明专利]一种基于改良聚乙二醇沉淀法分离外泌体的方法

说明书

本发明提供一种基于改良聚乙二醇沉淀法分离外泌体的方法，包括以下步骤：（1）将目标液体样本进行离心沉淀，收集沉淀和上清S1；（2）将步骤（1）里的沉淀重悬于分离液，混匀，加入DTT；（3）将步骤（2）得到的液体孵育混匀；（4）在步骤（3）得到的液体中加入分离液后混匀，再次离心收集上清S2；（5）将上清S1与上清S2进行混合，加入沉淀液混匀后0~10℃放置；（6）高速离心配合低速离心，去除上清，得到外泌体。本发明所述的外泌体分离方法，减少了现有技术分离外泌体时存在的非外泌体蛋白和其他杂质的共沉淀污染，外泌体的纯度和产量大幅地提高。

技术领域

本发明属于外泌体分离技术领域，具体涉及一种基于改良聚乙二醇沉淀法分离外泌体的方法。

背景技术

外泌体是一种活细胞在生理或病理状态下主动分泌到细胞外的膜性囊泡，其携带蛋白，运送RNA，其内容物包括蛋白质、短链肽、DNA片段、lncRNA、磷脂以及 miRNA。外泌体膜表面除了共有标记物(如CD9、CD63、CD81等)外，亦表达多种特异性标记物(如GPC1、GPC3、PSMA、TMEM256、EpCAM等)，这些特异性外泌体高度反映了宿主细胞类型和状态。研究显示，分离检测特异性外泌体对疾病诊断、治疗监控与预后判断具有重要意义，尤其在恶性肿瘤诊断方面具有很高诊断特异性和诊断灵敏度。

基于聚乙二醇的外泌体沉淀法是继超速离心之后应用最广的方法，占已发表论文的25％以上。聚乙二醇可与疏水性蛋白和脂质分子结合共沉淀，从而使溶解度较小的分子或外泌体在聚乙二醇溶液中溶解度降低并析出。该方法通常通过低速离心进行外泌体沉降，以减少样品和聚乙二醇溶液的混合。当前，基于聚乙二醇的外泌体沉淀法的技术，普遍存在难以克服的技术难题：纯度和回收率低，杂蛋白较多，颗粒大小不均一，生物聚合物难去除等。

因此，有必要提供改进的技术方案以克服现有技术中存在的技术问题。

发明内容

为解决现有技术存在的问题，本发明提供一种本发明通过改良基于聚乙二醇沉淀法的外泌体分离方法，减少了现有技术分离外泌体时存在的非外泌体蛋白和其他杂质的共沉淀污染，外泌体的纯度和产量大幅地提高。

本发明第一方面提供一种基于改良聚乙二醇沉淀法分离外泌体的方法，所述的外泌体分离方法包括：

（1）将液体样本以10,000~30,000g速度于37℃离心5~15分钟，收集沉淀和上清S1；

（2）将步骤（1）里的沉淀重悬于分离液，混匀，加入DTT；

（3）将步骤（2）得到的液体，37℃孵育5~15分钟，期间混匀3-5次；

（4）在步骤（3）得到的液体中，加入分离液，混匀，10,000~30,000g于37°C离心5~15分钟，收集上清S2；

（5）将步骤（1）所得的上清S1与步骤（3）所得的上清S2进行混合，再加入包含PEG8000的沉淀液，混匀后0~10℃放置1-12小时（可过夜冷藏）；

（6）将步骤（5）所得的成分，在10,000~20,000g室温离心20~30分钟，弃上清，然后再以1,000 ~2,000 g离心2~5分钟，去除所有液体，得到外泌体。

通过上述技术方案，可减少外泌体提取过程中非外泌体蛋白和其他杂质的共沉淀污染，使外泌体的纯度和产量大幅地提高。

优选地，在如前所述的基于改良聚乙二醇沉淀法分离外泌体的方法中，所述的基于改良聚乙二醇沉淀法分离外泌体的方法，其特征在于，所述的DTT的添加量为终浓度150~250 mg/mL。通过该技术方案，可使外泌体得到充分分散，使外泌体与非外泌体蛋白和其他杂质分离，以便于收集步骤（1）里沉淀中的外泌体。