[发明专利]聚焦肝细胞肝癌的蛋白小芯片的制备方法

说明书

本发明提供了一种聚焦肝细胞肝癌的蛋白小芯片的制备方法，采用含有21154个重组蛋白的HuProt^TM人类蛋白质组芯片对肝癌血清自身抗体进行筛选，比较和评价。本发明确定了有一定区分能力或组合区分能力的候选生物标志物，并构建了聚焦肝细胞肝癌的蛋白小芯片(HCC Focused Arrays)，为规模化检测血清样本和建立有效肝癌诊断模型提供了强有力的技术手段。

技术领域

本发明涉及生物医学领域，与应用性基础医学研究和临床研究相联系；涵盖肿瘤学、诊断学，蛋白质组学和免疫学。

背景技术

肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，简称：HCC)是常见的恶性肿瘤之一,其发病隐匿,恶性程度高,病死率高,因此及时准确的诊断对于提高患者的生存率至关重要。目前临床上主要运用甲胎蛋白(Alpha fetoprotein,简称：AFP)结合影像学及病理学检查进行肝癌的早期诊断；但是AFP对于肝癌筛查的特异性及敏感性均不十分理想。随着分子生物学的不断发展，多种新的标志物被相继发现，特别是自身抗体的诊断价值。

自身抗体是机体针对肿瘤异常抗原发生免疫响应而产生的特异性抗体，具有以下特点：(1)伴随肿瘤的发生过程产生，先于临床症状，适用于早期诊断；(2)自身抗体的产生是免疫反应的结果，经过免疫系统的放大，抗体比起蛋白更容易检测；(3)具有特定类型肿瘤特异性。研究发现存在一些抗原是肿瘤特有的，但不同肿瘤间无特异性，如p53；也有一些抗原是特定肿瘤特异性的，比如前列腺癌的很多抗原是氧化应激相关的蛋白。

发明内容

本发明的目的是提供一种聚焦肝细胞肝癌的蛋白小芯片的制备方法，为规模化检测血清样本和建立有效肝癌诊断模型提供强有力的技术手段。

本发明提供的一种聚焦肝细胞肝癌的蛋白小芯片的制备方法，采用含有21154个重组蛋白的HuProt^TM人类蛋白质组芯片对肝癌和健康人血清进行筛选，通过响应的数据比对和分析，确定候选生物标志物，点制聚焦肝细胞肝癌的蛋白小芯片。

进一步的，本发明的一种聚焦肝细胞肝癌的蛋白小芯片的制备方法，为了消除不同样品、不同芯片之间的系统性差异带来的误差，进行了芯片内和芯片间归一化处理。芯片内归一化：为消除同一张芯片内不同蛋白点之间由于背景值不一致导致的信号不均一的情况，实现方式为每个蛋白的前景值与背景值比值，即F/B，并此基础上定义SNR(信噪比)，即两个重复蛋白的F/B的均值。芯片间归一化：由于实验样本及实验操作带来的系统性误差，芯片之间直接进行数据比对可能导致结果的不确定性，故在数据比对前对SNR进行片间归一化处理，实现方法为中位值线性归一化。

进一步的，本发明提供的一种聚焦肝细胞肝癌的蛋白小芯片的制备方法，在归一化基础上，对数据进行统计学分析，以筛选出肝癌组特异性高响应蛋白，分析逻辑如下：

①参数检验t检验，p-value0.05即认为两者存在显著性差异；

②计算组间差异倍数，fold change≥1.2时，即认为两者存在潜在差异；

③以健康组样本为对象设置cut off＝mean+2SD(99％CI)，并计算HCC阳性率，以10％作为最低筛选标准。

进一步的，本发明筛选出候选生物标志物。

进一步的，本发明优选筛选出100个有一定区分能力或组合区分能力的候选生物标志物。

进一步的，本发明利用人源重组蛋白质，点制HCC Focused Arrays。