[发明专利]一种检测凋落物酸性磷酸酶活性的方法

权利要求书

1.一种检测凋落物酸性磷酸酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)在待测凋落物碎屑中加入培养缓冲液，低温孵育，离心收集滤液，进一步稀释得到酶活性液；

2)取部分酶活性液高温灭活，制得灭活酶液；

3)制作MUB浓度与吸光值之间关系的标准曲线；

4)将酶活性液和灭活酶液分别添加到酶活性孔和阴性对照孔，然后加入4-MUB-β-D-磷酸酯工作液，避光震荡孵育，反应结束后加入终止液终止反应，在检测条件下，读取荧光值；

5)根据标准曲线，计算酸性磷酸酶比酶活＝(A_活-A_灭)*R/(b*t*m)，式中，A_活为酶活性孔的吸光值，A_灭为阴性对照孔的吸光值，R为酶活性孔中所加入的酶活性液的稀释系数，b为标准曲线的斜率，t为避光震荡孵育时间，m为凋落物的干重。

2.根据权利要求1所述的检测凋落物酸性磷酸酶活性的方法，其特征在于，步骤1)中，所述培养缓冲液的制备方法为：将3.025g Tris、3.9g马来酸、3.5g柠檬酸或3.825g一水柠檬酸、1.56g硼酸和122mL 1M氢氧化钠，用去离子水定容至250mL制备得到缓冲液原液；再将100mL所述缓冲液原液用盐酸调至pH 4.5，用去离子水定容至1000mL，灭菌后4℃备用。

3.根据权利要求1所述的检测凋落物酸性磷酸酶活性的方法，其特征在于，步骤1)中，所述低温孵育为4℃孵育1h。

4.根据权利要求1所述的检测凋落物酸性磷酸酶活性的方法，其特征在于，步骤1)中，所述凋落物碎屑与培养缓冲液的比例为0.15g∶600μL。

5.根据权利要求1所述的检测凋落物酸性磷酸酶活性的方法，其特征在于，步骤4)中，所述酶活性液或灭活酶液与4-MUB-β-D-磷酸酯工作液的体积比为1∶2，所述4-MUB-β-D-磷酸酯工作液的浓度为1200μM。

6.根据权利要求1所述的检测凋落物酸性磷酸酶活性的方法，其特征在于，步骤4)中，所述终止液为Tris终止液，pH为10-11，浓度为1M；所述终止液的体积为酶活性液或灭活酶液与4-MUB-β-D-磷酸酯工作液的体积和。

7.根据权利要求1所述的检测凋落物酸性磷酸酶活性的方法，其特征在于，步骤4)中，孵育温度为22℃，孵育时间为30min，震荡频率为160rpm。

8.根据权利要求1所述的检测凋落物酸性磷酸酶活性的方法，其特征在于，步骤4)中，检测条件为：激发光波波长364nm，发射光波波长450nm，滑动宽度为5nm，收集时间为0.5s。

9.根据权利要求1所述的检测凋落物酸性磷酸酶活性的方法，其特征在于，所述待测凋落物的制备方法为：采集刚自然脱落的植物器官组织，杀青烘干，放入分解袋中，距离植物主干0.5-1m埋入并用原表层0-10cm土壤覆盖并轻轻压实，埋藏至预设时间后，取出，去掉泥沙杂质，即为待测凋落物。