[发明专利]一种长白落叶松胚性愈伤组织胚性恢复与保持的方法

说明书

本发明的目的是恢复和保持长白落叶松胚性愈伤组织的胚性—通过调节胚性愈伤组织继代培养基中激素浓度的方法。胚性愈伤组织在S+0.1mg·L^‑12，4‑D+0.04mg·L^‑1BA+0.02mg·L^‑1KT激素条件下，继代6个月后发现胚性愈伤组织的体胚分化率急剧下降。经去除2，4‑D，逐渐降低NAA的方法恢复胚性：将胚性愈伤组织接种在每2周NAA浓度从0.5、0.4、0.3、0.2、0.1mg·L^‑1依次降低的S培养基中进行胚性恢复培养，其中S培养基中激素还包含0.5mg·L^‑1BA、0.5mg·L^‑1KT。最终在S+0.2mg·L^‑1NAA+0.5mg·L^‑1BA+0.5mg·L^‑1KT+0.5g·L^‑1谷氨酰胺+0.5g·L^‑1水解酪蛋白+30g·L^‑1蔗糖+3g·L^‑1植物凝胶培养条件下持续继代2年，胚性仍然保持良好。将胚性恢复的愈伤组织经分化培养后，体胚发生率可达100％。将发育正常的体细胞胚胎转入萌发培养基中，4周后成苗率可达46.2％。

技术领域

本发明涉及一种落叶松胚性愈伤组织胚性恢复与保持的方法。本发明属于林业生物技术领域。

背景技术

长白落叶松(Larix olgensis)别名黄花落叶松、朝鲜落叶松 ，属松科、落叶松属高大乔木，其木材重而实、耐久用，是我国东北地区营造短周期天然林不可代替的树种。利用落叶松未成熟合子胚诱导的胚性愈伤组织，在持续继代过程中存在着胚性下降甚至消失的问题，严重制约着落叶松体细胞胚胎发生途径和林木遗传转化工作的研究。

1989年Kimaszewska等以日本×欧洲杂种落叶松(Larix×eurolepis)的未成熟合子胚为材料，诱导出胚性愈伤组织，在持续继代过程中发现体胚分化率下降，发现用0.4％结冷胶代替1.0％琼脂的MSG培养基可以长久维持愈伤组织的胚性(Klimaszewska K.PlantScience,1989,63(1):95-103)。相继在美西落叶松(Larix occidentalis)(Thompson R G,Aderkas P V.Plant Cell Reports,1992,11(8):379-385)、日本×杂种落叶松(Larix ×leptoeuropaea)(Lelu M A,Klimaszewska K,Charest P J.Revue Canadienne DeRecherche Forestière,1994, 24(1):100-106)、北美落叶松(Larix laricina)(Klimaszewska K,Devantier Y,Lachance D,Canadian Journal of Forest Research,1997,27(4):538-550)、日本落叶松(Larix leptolepis)(Kim Y W,Youn Y,Noh E R,etal. Plant Cell,Tissue and Organ Culture,1998,55(2):95-101)、华北落叶松(Larixprincipis-Rupprechtii)(Li Q I,Ewald D,Ying H S.Acta Biologiae ExperimentalisSinica,2000,33(4):357)、日本×长白；日本×兴安杂种落叶松(Larix kaempferi×L.olgensis；Larix kaempferi×L.gemlinii)(王伟达,李成浩,杨静莉,等.林业科学,2009, 45(8):34-38)、西伯利亚落叶松(Larix sibirica)(Tret’yakova I N,Barsukova AV.Russian Journal of Developmental Biology,2012,43(6):353-361)、长白落叶松(Larix olgensis)(宋跃，张含国，等.林业科学, 2016,52(10):45-54)等落叶松属的胚性愈伤组织在持续继代过程中均发现胚性下降，体胚发生率降低的问题。因此，利用植物组织培养技术对胚性愈伤组织进行胚性恢复和保持显得格外重要。