[发明专利]一种针对性富集血浆目标游离DNA的方法

说明书

本发明公开了一种针对性富集血浆目标游离DNA的方法，所述方法包括样品预处理、样品裂解、磁珠分选、洗涤液清洗、和洗脱等步骤，从而将DNA富集以及DNA片段筛选合二为一，在核酸富集的过程中，一并对核酸片段大小进行筛选，获得目标产物，为特定的分子诊断实验提供更灵敏的检测保障，也节省了操作。

技术领域

本发明涉及DNA检测领域，具体涉及一种针对性富集样品中目标游离DNA的方法。

背景技术

自从Mander和Metais于1948年发现人体外周血中存在着细胞外游离DNA和RNA后，游离核酸的检测作为一种有效的微创性诊疗手段广泛应用于临床的各个方面，如肿瘤的发生发展、妊娠相关性疾病、自身免疫病、移植排斥反应、创伤急救医学等，其检测在疾病的早期诊断、分期、治疗检测、预后判断以及产前分子诊断等方面有着重要意义。

随着分子生物学技术的高速发展，DNA富集在诸多分子诊断以及检测技术中日益凸显其重要性，DNA提取富集是生物学分子诊断的前提与基础，且DNA富集质量对下游分子诊断结果起直接影响作用。除却传统的DNA核酸富集方法：酚抽提法、碱裂解法、CTAB抽提法以及EtBr-CsCl梯度离心法等。目前常见的DNA富集方法包括离心柱提取法、玻璃珠吸附法、二氧化硅基质法、阴离子交换法和纳米磁珠提取法。其中，离心柱提取法以其便捷且价格亲民的优势获得广泛应用，随着分子诊断行业的迅猛发展，针对诊断的目的性，研究人员对需要富集的DNA要求越来越严格，离心柱DNA提取日益不能满足对富集的DNA提取总质量增多的需求。

为了顺应分子诊断行业发展需要，磁珠法DNA富集越来越被得到肯定，它有着其他DNA提取方法不能抗衡的优势。磁珠法提取的原理是纳米磁珠表面带带有特定活性基团，在特定条件下可与核酸进行特异性可逆结合，利用磁珠自身具备的磁响应能力，在外加磁场的作用下可方便地进行定向移动与富集，进而实现对核酸的分离纯化。该方法的优势在于：低投入量；全程无需离心操作，操作简单；可实现全自动化操作满足高通量需求；无毒无害，不涉及任何酚、氯仿等有毒化学试剂。

特定目的的DNA检测对于待测DNA片段的大小通常具有特定的要求但是现有的磁珠DNA富集方法并不能很好地满足后续检测对于DNA片段选择性的要求。例如，母体来源的DNA比胎儿DNA长，胎儿DNA绝大部分300bp，而母体来源的DNA平均1kb。因此，通过选择性去除母体血浆中母体来源的大片段游离DNA，从而提高母体血浆中胎儿游离DNA比例，降低检测过程中母源cffDNA背景的方法可提高利用cffDNA进行无创产前诊断的特异性和敏感度，扩展其适用范围，促进该诊断技术的发展和在临床上的推广应用。因此，亟需能够针对性富集血浆目标游离DNA的方法

发明内容

本发明对目前磁珠法富集DNA技术进行了优化，将DNA富集以及DNA片段筛选合二为一，即在核酸富集的过程中，一并对核酸片段大小进行筛选，获得目标产物，此为特定的分子诊断实验提供更灵敏的检测保障，也节省了操作时长。

为实现上述目的，本发明提出一种针对性富集样品中目标游离DNA的方法，所述的方法包括以下步骤：

S1.将样品进行预处理；

S2.向预处理后样品中依次加入蛋白酶、裂解液，混匀各组分并孵育以进行样品裂解获得裂解液；

S3.向裂解液中加入磁珠，混匀，获得混合物1；

S4.使混合物1中磁珠被吸附，获取上清液；

S5.向上清液中再次加入磁珠，混匀，获得混合物2；

S6.使混合物2中磁珠被吸附，去除上清液；

S7.使用洗涤液清洗；

S8.加入洗脱液，使磁珠上的游离DNA洗脱，