[发明专利]一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法

权利要求书

1.一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、制备混合细胞悬液

取新鲜离体的肿瘤组织，剪碎，加入含胶原酶Ⅰ的DMEM不完全培养基，将混合液转移到离心管中，振荡消化肿瘤细胞，经离心后弃上清液；使用胰蛋白酶振荡消化，再用DMEM完全培养基终止消化，经过滤、离心后，弃上清液，加入4℃的PBS振荡混匀，制成所需混合细胞悬液；

步骤二、胎牛血清分离肿瘤细胞

取新离心管，加入胎牛血清，将步骤一得到的混合细胞悬液沿离心管壁缓慢加入到胎牛血清的上层，混合细胞悬液不能进入胎牛血清内，加完后放置到培养箱中静置10-20min；

步骤三、时间差异消化纯化肿瘤细胞

吸取步骤二离心管管底的细胞悬液，经离心后加入1640完全培养基，进行细胞培养，培养2-4天后吸走培养基，加入胰蛋白酶差异消化10-20s，吸走胰蛋白酶，离心吹打得到的冲洗液得到新的细胞悬液，继续进行培养，获得所需纯化原代肿瘤细胞。

2.根据权利要求1所述的一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法，其特征在于，步骤一中，将接种人肺腺癌A549的荷瘤小鼠颈椎脱臼处死，泡于75％酒精4-6min；在细胞间的超净台内用剪刀剪开裸鼠皮肤，在不出血情况下分离出肿瘤组织，离体的肿瘤组织浸泡于0.01MPBS中，并剪碎，加入10-15mL含10mg胶原酶Ⅰ的DMEM不完全培养基，吹散肿瘤组织，把混合液转移到离心管中，使用振荡器振荡消化3-5min，然后放于37℃水浴锅1-2min，循环10-15次，随后离心，弃上清液，再加入15-20mL 0.01M PBS，振荡混匀，离心，弃上清液，重复离心2-3次。

3.根据权利要求1所述的一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法，其特征在于，步骤一中，加入5-10mL胰蛋白酶，使用振荡器振荡消化5-10min，加入30-40mL DMEM完全培养基终止消化，吹匀后将离心管中的液体倒入80目的筛子过滤，过滤后的液体转移到新离心管中，离心，弃上清液，加入15-20mL 0.01M PBS，振荡混匀，离心，弃上清液，重复3-5次，加入5-10mL、4℃的0.01M PBS振荡混匀，制成混合细胞悬液。

4.根据权利要求1或3所述的一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法，其特征在于，所述胰蛋白酶为：NaCl 0.08g、NaHCO₃ 0.005g、葡萄糖0.01g、EDTA 0.003g、胰蛋白酶0.025g和DDH₂O 10g。

5.根据权利要求1或3所述的一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法，其特征在于，所述DMEM完全培养基为：体积百分比10％的胎牛血清、体积百分比89％的DMEM不完全培养基和体积百分比1％的P/S。

6.根据权利要求1所述的一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法，其特征在于，步骤二中，取一新离心管，加入胎牛血清5-15mL，吸取步骤一得到的混合细胞悬液，将混合细胞悬液沿离心管壁缓慢加入到胎牛血清液体的上层，加完后放置到37℃培养箱中静置10-20min。

7.根据权利要求1所述的一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法，其特征在于，步骤三中，吸取离心管管底的细胞悬液1-2mL，挪到新离心管中，加入15-20mL 0.01M PBS，振荡混匀，离心，弃上清液，向离心管中加入1640完全培养基，吹打混匀，采用六孔板进行细胞培养，培养2-4天后吸走培养基，用0.01M PBS吹洗六孔板，再加入4℃胰蛋白酶消化10-20s，吸走胰蛋白酶，用0.01M PBS冲洗六孔板，得到冲洗液，离心冲洗液，对其中的细胞进行继续培养，获得纯化后的原代肿瘤细胞。

8.根据权利要求1或7所述的一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法，其特征在于，所述1640完全培养基为：体积百分比10％的胎牛血清、体积百分比89％的1640不完全培养基和体积百分比1％的P/S。