[发明专利]一种液相色谱串联质谱检测血浆儿茶酚胺及其代谢物的方法

权利要求书

1.一种使用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪检测血浆中儿茶酚胺及其代谢物含量的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

(一)标准溶液的配制

(a)标准曲线溶液配制：

分析天平精确称取3-甲氧酪胺(3-MT)、变肾上腺素(MN)、去甲变肾上腺素(NMN)、多巴胺(DA)、肾上腺素(E)、去甲肾上腺素(NE)，各标准品分别用含维生素C甲醇水溶液溶解，配制标准品储备液；使用甲醇水溶液稀释标准品储备液，配制混合标准曲线工作液；使其浓度范围分别为：3-甲氧酪胺3.9-1000pg/mL、变肾上腺素9.76-2500pg/mL、去甲变肾上腺素9.76-2500pg/mL、多巴胺19.5-5000pg/mL、肾上腺素19.5-5000pg/mL和去甲肾上腺素78-20000pg/mL；

(b)内标溶液配制：

分析天平精确称取3-甲氧酪胺-d4(3-MT-d4)、变肾上腺素-d3(MN-d3)、去甲变肾上腺素-d3(NMN-d3)、多巴胺-d4(DA-d4)、肾上腺素-d6(E-d6)、去甲肾上腺素-d3(NE-d3)，各内标分别用含维生素C甲醇水溶液溶解，配制内标储备液；使用甲醇水溶液稀释内标储备液，配制混合内标工作液；使其浓度分别为：2～10ng/mL 3-甲氧酪胺-d4、10～50ng/mL变肾上腺素-d3、10～50ng/mL去甲变肾上腺素-d3、10～50ng/mL多巴胺-d4、2～10ng/mL肾上腺素-d6和10～50ng/mL去甲肾上腺素-d3；

(c)质控品配制：

分析天平精确称取3-甲氧酪胺、变肾上腺素、去甲变肾上腺素、多巴胺(DA)、肾上腺素、去甲肾上腺素，各标准品分别用含维生素C甲醇水溶液配制质控品储备液；使用水溶液稀释质控品储备液，分别配制低浓度、中浓度、高浓度，三个浓度混合质控品工作液；将10～20人份的血浆配制混合血浆，加入不超过混合血浆总体积10％的混合质控品工作液，混合均匀，得到低浓度质控品(LQC)、中浓度质控品(MQC)、高浓度质控品(HQC)；每支500μL分装于EP管中，储存于-80℃冰箱中备用；

(二)血液的离心

取待检血液至少4mL，在离心速度为3000rpm下离心15min，分离得到上清液血浆，置于-80℃保存备用；

(三)待测血浆样本/标准曲线溶液/质控品处理

用移液枪移取内标工作液50μL于1.5mL离心管中，然后加入400μL待测血浆样本/标准曲线溶液/质控品于上述离心管中，加入10μL含有50mmol/L乙酸铵的缓冲液，混合均匀；分别用200μL甲醇和水对固相萃取(SPE)柱进行活化处理，再分别将上述处理好的血浆、标准曲线溶液和质控品全部转移至活化后的SPE柱；依次用200μL 20mmol/L乙酸铵溶液和200μL50％乙腈异丙醇溶液洗涤，抽至近干后，用100μL 98％乙腈2％甲酸溶液洗脱，收集洗脱液，供高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪检测；

(四)待测样本的检测

使用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述待测血浆样本/标准曲线溶液/质控品进行检测；

所述高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪所使用的分析色谱柱为Xbridge Amide柱，填料粒径为1.7～5μm，内径2.1～4.6mm，柱长50～150mm；柱温为30～40℃，进样量为5～20μL；

所述分析色谱柱的流动相A为含有0.5％甲酸水溶液和B为含有0.5％甲酸乙腈溶液，流速为0.4mL/min，分析色谱柱采用梯度洗脱方式，所述梯度洗脱的程序参数如下：

所述高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪检测采用电喷雾离子源(ESI)和多反应监测(MRM)扫描模式，具体的定量离子对与定性离子对如下：

；

通过标准曲线溶液的浓度及峰面积，拟合得到标准曲线方程，通过待测血浆样本的峰面积计算出待测血浆样本中的3-甲氧酪胺，变肾上腺素，去甲变肾上腺素，多巴胺，肾上腺素和去甲肾上腺素的浓度。

2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：在步骤(a)、步骤(b)和步骤(c)中，配制标准品储备液中使用的抗氧化剂维生素C水溶液浓度是5～20mg/mL；配制标准品溶液使用的甲醇水溶液，其中甲醇含量为50～90％。