[发明专利]6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备他克莫司检测试剂中的用途

说明书

本申请涉及6‑磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备他克莫司检测试剂中的用途。具体而言，本申请的6‑磷酸葡萄糖脱氢酶突变体相较于野生型6‑磷酸葡萄糖脱氢酶包含选自以下的一个突变或其组合：D306C、D375C、G426C。使用本申请的6‑磷酸葡萄糖脱氢酶突变体所制备的检测试剂盒，其特异性强、灵敏度高、操作方便、检测时间短、定量准确，适合高通量检测。

本申请要求2019年1月9日提交的申请号为201910017764.4和2019年5月21日提交的申请号为201910423122.4《6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备检测试剂中的用途》的优先权，其通过引用并入此处。

技术领域

本申请涉及生物检测领域，特别是涉及一种突变的酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶(简称G6PDH)及其在他克莫司检测试剂盒中的应用。

背景技术

半抗原，某些小分子物质(分子量小于4000Da)，其单独不能诱导免疫应答，即不具备免疫原性，但当其与大分子蛋白质或非抗原性的多聚赖氨酸等载体交联或结合后可获得免疫原性，诱导免疫应答。这些小分子物质可与应答效应产物结合，具备抗原性，它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。

半抗原能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应，又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。大多数多糖、类脂、激素、小分子药物都属于半抗原。如果用化学方法把半抗原与某种蛋白分子(载体)结合，会获得新的免疫原性，并能刺激动物产生相应的抗体。

小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，多采用竞争模式。原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，显色愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。

他克莫司(tacrolimus)作为半抗原的具体实例，结构式如下所示：

他克莫司又称FK506，是一种大环内酯类抗生素。1984年他克莫司在日本被发现，1989年作为免疫抑制剂首次应用于临床。他克莫司作为一种免疫抑制剂，具有很高的亲脂性，吸收不完全且不稳定。

他克莫司安全而有效的治疗范围很窄，他克莫司的剂量不足或者血药浓度过低可能会导致移植排斥反应。他克莫司浓度过高又会导致严重的不良反应，不良反应包括肾毒性、神经毒性、移植后糖尿病、对传染易感性增加、癌变、高血压、以及胃肠道功能紊乱等。

基于上述原因，他克莫司血药浓度监测，是辅助临床治疗、改善治疗效果、降低毒性风险的有效方式。

目前已知的他克莫司检测方法主要有：高效液相色谱法(HPLC)、发光免疫、酶联免疫吸附剂测定(ELISA)等方法。HPLC法需要复杂的样品前处理，操作复杂周期长且成本昂贵；发光免疫法试剂成本昂贵，不适合常规治疗药物检测，更不利于大范围推广。

现有的均相酶免疫测定法、胶乳凝集比浊法常常因制备工艺复杂、批间差大，应用受到一定限制。

现有技术CN108107200A描述了一种他克莫司检测试剂盒，其中公开了6-磷酸葡萄糖脱氢酶和他克莫司偶联物的制备方法：

-将20-100mg他克莫司溶于甲醇中，加入无水乙酸钠，溶解均匀后加入羧甲基羟胺，溶解混匀，氮气保护下加温反应过夜，然后减压蒸馏得蜡状物，加入二甲基甲酰胺溶解，过滤去除沉淀，减压蒸馏去除溶剂得产物A；

-用20-100mL二甲基甲酰胺溶解10-50mg产物A，再将50-150μL的碳二亚胺(EDC)在搅拌下缓慢滴加到上述溶液中，旋转混合60-150分钟；

-取10-50mg规格为100-300KU的6-磷酸葡萄糖脱氢酶的溶解于PBS缓冲液中震荡均匀；