[发明专利]用于冷冻生物溶液的装置和方法

说明书

本公开提供了在无菌条件下和在小体积容器中用于冷冻含有敏感物质如生物制药材料的液体混合物或悬浮液的系统和方法。公开的装置能够控制溶液的冰成核，最小化冻结的体积层，同时以自下而上的几何形状控制冰生长速率，并且包括具有控制温度的装置的热传递表面(101)、用于多个容器(109)的支架(102)、用于将支架压靠在热传递表面以及任选的接触促进材料上的按压装置(103)。公开的方法包括将装置预冷却至基本上低于溶液成核温度的温度，将容器放置于支架中，使容器与热传递表面接触直到分数为10％的总样品体积被冻结；中断容器与热传递表面之间的接触；以预定冷冻速率使容器与热传递表面接触，使得生物溶液的冷冻是统一的；直到所有体积的溶液被冻结。

技术领域

本公开总体上涉及一种用于将包含敏感物质(例如生物材料)的液体混合物或悬浮液冷冻在多个小体积容器中的装置和方法，特别地其中生物材料是活细胞、血细胞、病毒、蛋白质、抗体等。此外，本公开改善了在多个容器中冷冻小体积的水性混合物期间成核和晶体生长的再现性。

背景技术

敏感物质的冷冻保存对于许多应用是必不可少的，与细胞生物学的开发有关。通常将其培养产生的细胞或衍生物冷冻保存，以管理生产和分配，包括储备用于保存其遗传物质。

现有系统的主要限制之一是由于与冷冻和解冻现象相关的复杂性导致的不一致。由于治疗和安全限制，这对于细胞疗法特别重要，其可能由于低效的冷冻保存而严重受损。

冷冻保存涉及不同的过程，例如添加冷冻保护物质、冷却(冷冻)、加热(解冻)、混合，其决定了生物产品的物理化学稳定性。由于冷冻保存涉及一系列过程，因此不一致性很可能从最初(例如冷却和冷冻)到最后(例如解冻和混合)传递和放大。因此，最大化冷冻一致性对于最大化生物产品的整体保存至关重要。

许多变量导致冷冻不一致，例如自然对流、成核温度、冰晶生长速率、过冷等。与冷冻一致性有关的两个主要问题是难以控制的，即自然对流和冰成核。

自然对流是发生在生物品的冷冻溶液中的溶质分布不均匀(低温浓缩或冷冻浓缩)的主要原因。已经显示出密度梯度驱动的对流是至关重要的，因为它使溶质向圆柱形容器底部和中心转移。据报道，通过使用非对流冷冻几何形状，即从底部到顶部单向冷冻，冰枝晶的形成会减弱自然对流，从而防止低温浓缩[1,2]。

冷冻保存的另一个关键方面是冰成核温度和位置的控制。在冷冻过程中，水溶液趋于在冰成核发生之前冷却至其熔点以下的温度，这种情况称为过冷。据描述，这对解冻后并因此在整个冷冻保存过程中的细胞存活力具有损害作用。为了减少过冷，已经提出了几种控制冰成核的技术。就像将小的冰晶或冰的异质成核剂引入样品中一样；通过在低温容器外部手动产生冷点；通过电冷冻；通过机械方法(摇动、施加超声波)；通过冲击冷却或通过压致偏移[3]。

尽管已经开发了许多方法，但是大多数方法都难以标准化并且不能在无菌条件下以高水平的再现性整合到多个小体积容器中，确保在整个冷冻保存过程中的细胞活力和再现性。此外，已描述的提高冷冻一致性的大多数方法都已应用于大于10ml的体积。较大的体积可以更容易地控制热通量，这是由于较大的热传递面积和溶液的热惯性。相反，对于较小的体积(例如100μl)，进行必要的控制以实现小瓶底部的局部成核，同时不损害单向自下而上的冷冻面临一些技术挑战。