[发明专利]工程化苯丙氨酸氨裂合酶多肽

说明书

本发明提供了工程化苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)多肽及其组合物，以及编码工程化苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)多肽的多核苷酸。还提供了用于产生PAL酶的方法。在一些实施方案中，工程化PAL多肽被优化以提供增强的催化活性，所述催化活性可用于在工业工艺条件下产生药物化合物。

本申请要求分别于2018年7月12日和2019年3月6日提交的美国专利申请序列号62/696,978和62/814,362的优先权，这两项美国专利申请在此出于所有目的通过引用以其整体并入本文。

发明领域

本发明提供了工程化苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)多肽及其组合物，以及编码工程化苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)多肽的多核苷酸。还提供了用于产生PAL酶的方法。在一些实施方案中，工程化PAL多肽被优化以提供增强的催化活性，所述催化活性可用于在工业工艺条件下产生药物化合物。

对序列表、表格或计算机程序的引用

序列表的正式副本作为ASCII格式化文本文件经由EFS-Web与说明书同时提交，文件名为“CX2-179WO1_ST25.txt”，创建日期为2019年6月12日，且大小为4.16兆字节。经由EFS-Web提交的序列表为说明书的一部分并且通过引用以其整体并入本文。

发明背景

苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)(参见例如，Cui等人,Crit.Rev.Biotechnol.,34:258-268[2014]；Hyun等人,Mycobiol.,39:257-265[2011]；MacDonald等人,Biochem.CellBiol.,85:273-282[2007])连同组氨酸氨裂合酶(HAL)和酪氨酸氨裂合酶(TAL)一起(参见例如，Kyndt等人,FEBS Lett.,512:240-244[2002]；Watt等人,Chem.Biol.,13:1317-132[2006]；和Xue等人,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.,34:599-604[2007])是芳族氨基酸裂合酶家族(EC 4.3.1.23-1.25和4.3.1.3)的成员。更具体地，具有PAL活性的酶(EC4.3.1.23-1.25，并且先前分类为EC 4.3.1.5)催化将L-苯丙氨酸非氧化脱氨为(E)-肉桂酸(方案1)。

该反应是可逆的，并且因此PAL催化(E)-肉桂酸的胺化，在高浓度的氨的存在下或者在溶液中释放氨的物质的存在下产生L-苯丙氨酸(方案1)。

PAL为一种非哺乳动物酶，广泛分布于植物中并且还在真菌和有限数目的细菌中被鉴定出。它通常是一种典型质量为300-340kDa的四聚体(参见例如，Cui等人,Crit.Rev.Biotechnol.,34:258-268[2014])。它不需要外部添加的辅因子，而是通过三个残基，即丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸的自环化和脱水在酶的活性位点形成辅因子，以形成充当亲电试剂来催化反应的3,5-二氢-5-亚甲基-4H-咪唑-4-酮(MIO)(参见例如，MacDonald和D’Cunha,Biochem.Cell Biol.,85:273-82[2007])。

手性胺化合物作为中间体或合成子常用于制药、农业化学和化学工业中，用于制备许多商业上期望的化合物。据估计，目前40％的药物含有胺官能度(aminefunctionality)(参见例如，Ghislieri和Turner,Top.Catal.,57:284-300[2014])。通常，手性胺化合物的这些工业应用涉及仅利用分子的一种特定的立体异构形式(例如只有(R)对映异构体或(S)对映异构体是生理学活性的)。