[发明专利]通过获取自RNA的CRISPR间隔序列进行转录记录

权利要求书

1.一种用于记录细胞的转录物，特别是记录细胞的转录组的方法，所述方法包括以下步骤：

-提供测试细胞，其包含：

·编码包含逆转录酶多肽和Cas1多肽的融合蛋白的第一转基因核酸序列，和编码Cas2多肽的第二转基因核酸序列，其中所述第一转基因核酸序列和所述第二转基因核酸序列受诱导型启动子序列的转录控制，和

·包含CRISPR同向重复(DR)序列的第三转基因核酸序列；其中所述CRISPR同向重复序列可被所述第一转基因核酸序列和所述第二转基因核酸序列的表达产物形成的RT-Cas1-Cas2复合物特异性识别，

-在暴露步骤中，将所述测试细胞暴露于诱导所述第一转基因核酸序列和所述第二转基因核酸序列表达的条件，其中所述RT-Cas1-Cas2复合物是由所述第一转基因核酸序列和所述第二转基因核酸序列的表达产物形成的，

○由一种或多种核酸分子，更特别是一种或多种RNA分子获取至少一种原间隔序列，特别是多于一种的原间隔序列，和

○将所述原间隔序列作为间隔序列整合到所述第三转基因核酸序列中，

产生经修饰的第三转基因核酸序列，其包含至少一个整合的间隔序列，

-从所述测试细胞中分离所述经修饰的第三转基因核酸序列，产生分离的经修饰的第三转基因核酸序列，和

-对所述分离的经修饰的第三转基因核酸序列进行测序。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第三转基因核酸序列还包含CRISPR前导序列，其中所述CRISPR前导序列可被所述RT-Cas1-Cas2复合物特异性识别，所述RT-Cas1-Cas2复合物由所述第一转基因核酸序列和所述第二转基因核酸序列的表达产物形成。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第三转基因核酸序列不包含任何另外的CRISPR同向重复序列。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述测试细胞另外包含

-编码传感物的第四转基因核酸序列，其中所述传感物在与分析物分子接触时将被激活，产生激活的传感物，其中所述激活的传感物将诱导细胞内记录基因的表达；

并且其中在所述暴露步骤中，如果存在所述分析物分子，则所述激活的传感物诱导细胞内记录基因的表达，并且获取源自所述记录基因的RNA作为间隔序列。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述CRISPR前导序列和/或所述CRISPR同向重复序列可被以下菌株的RT-Cas1-Cas2复合物或源自其的RT-Cas1-Cas2复合物特异性识别：解糖纺锤链杆菌、待定弯曲假丝酵母菌、砂真杆菌、脆弱类杆菌、胎儿弯曲杆菌、船蛆杆菌、海栖木洞菌、巴氏脱硫菌、生脂固氮螺菌、青绿纤维单孢菌、小单孢菌、卡氏单歧藻菌、颤蓝藻菌或胶须蓝菌种。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述测试细胞是大肠杆菌细胞。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第三转基因核酸序列包含在载体内，特别是表达载体内。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述第一转基因核酸序列和所述第二转基因核酸序列包含在所述载体内。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中诱导所述第一转基因核酸序列和所述第二转基因核酸序列表达的所述条件导致所述第一转基因核酸序列和所述第二转基因核酸序列的过表达。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中诱导所述第一转基因核酸序列和所述第二转基因核酸序列表达的所述条件

-包括使所述测试细胞与诱导剂化合物接触，特别是IPTG、乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖或脱水四环素；或

-包括厌氧条件，并且所述诱导型启动子是厌氧诱导型启动子。