[发明专利]多点照明器、共焦滤光器、共焦显微镜及其操作方法

说明书

一种用于光学显微镜(M)的可设计的多点照明器包括光源(1、2)以及对来自光源的光束进行调制的空间光调制器(SLM)。经调制的光束旨在跨被放置在显微镜物镜(21)下的样本进行扫描，样本设置有荧光团。SLM包括第一声光偏转器(8)和第二声光偏转器(9)，第一声光偏转器具有第一调制平面(81)，并且第二声光偏转器具有第二调制平面(91)，所述两个声光偏转器级联地布置，以提供不同方向上的相应偏转，从而使得SLM能够跨样本在两个维度上进行扫描。SLM还包括使第一调制平面与第二调制平面共轭的望远镜转像器(10)。照明器还包括任意波形发生器(13)，该任意波形发生器被配置成合成全息图并且被布置成同时将第一这种全息图注入到第一声光偏转器中，并将第二这种全息图注入到第二声光偏转器中，以便使SLM响应于所述全息图而对光束进行调制。

技术领域

本公开涉及一种用于光学显微镜的可设计的(programmable)多点照明器，并且涉及使所述显微镜成为共焦显微镜的共焦滤光器。本公开还涉及一种对共焦显微镜进行操作的方法。

照明器包括光源以及对来自该光源的光束进行调制的空间光调制器，经调制的光束旨在跨被放置在显微镜的物镜下的样本进行扫描，该样本通常设置有荧光团。表述“样本被放置在显微镜物镜下”是指要通过物镜将光束聚焦在样本中(该表述不应理解为样本始终位于物镜下方)。

背景技术

共焦显微术是细胞生物学所有领域中用于样本可视化的参考技术，并且被公认为是光学显微术中曾做出的最重要的发明之一。近年来，共焦显微镜在普及程度方面享有惊人的爆发，并且全球大多数大学和科研机构以及越来越多的个人实验室都拥有共焦显微镜。

共焦显微镜本质上有两种不同形态：单点扫描仪器和多点扫描仪器。它们通常与荧光标签(荧光分子或荧光团)组合使用，所述荧光标签选择性地标记关注结构，并且通过发射更长波长的光来对照明激光做出响应(斯托克斯位移)。这种波长漂移允许借助于分色镜(dichroic mirror)和滤光器来将激发光学系列和发射光学系列轻松隔离。

单点共焦显微镜基于单个激光束，该激光束逐点地对样本进行逐步扫描，在通过与激光点共轭的小针孔孔径将样本发射的光滤除之后，这导致了高分辨率、高对比度以及光学分段的图像。聚焦平面上和聚焦平面下的由经激发的荧光团发射的光被针孔拦截，并且不会到达检测器，从而在对厚样本进行成像时使困扰非共焦显微镜的光雾最小化。

然而，这种逐点扫描方法伴随着明显降低的图像获取速度，这是单点共焦的主要局限性。通常必须固定(即，杀死)诸如细胞的活样本来获得没有运动模糊的图像，因为该仪器无法解决许多细胞症候(cellular phenomena)的时间动态。

因此，更快的扫描已成为现代共焦显微术发展的关键媒介。然而，使用单个激光点进行扫描是无法变得任意快的：高扫描速率意味着激光点只能在非常短的曝光时间(以微秒为标度)期间照明任何采样点。为了补偿这种小的激发时间，必须增大落在样本上的激光功率，这很快就使荧光团变饱和。以到达检测器的光子的总量将随着曝光时间的减少而减小的这种方式，高于饱和阈值的激光功率增量不会导致荧光发射速率的等效增量，因而将扫描速度的极限设定在每秒钟几帧左右。

使得能够实现快速共焦操作的唯一技术方案是使用多个激光点对样本进行并行扫描。

响应于这种需要，已经开发了多点共焦。多点共焦使用数千个激光小束(beamlet)来同时扫描样本，因而能够达到每秒钟数百帧的范围内的帧速率。将总功率分成许多激光焦点的附加优点是，这些仪器对生物样本是相当柔和的(在可比条件下，损伤比单点共焦少1/15)，从而使光漂白和光毒性最小化。

然而，多点扫描原理的商业实现方式基于以高速旋转的、被微小的显微透镜和针孔的阵列覆盖的圆盘(尼普可夫圆盘)，这使得系统不灵活且光学效率低下。实际上，旋转圆盘显微镜无法对样本中的任意关注区域进行扫描，并且匹配至通常具有高放大倍率和高数值孔径的透镜的单个物镜。而且，典型的尼普可夫圆盘的光学效率约为4％，从而需要大功率的激发激光器，这是昂贵的。