[发明专利]方法

说明书

本发明涉及用于病原体检测的生物安全装置，并提供了一种生物安全反应容器和制备用于基于PCR的病原体检测的样品的方法。反应容器包含反应室部分(1)、盖保持器部分(2)和盖(3)。在盖(3)和反应室部分(1)之间提供2个安全点，例如2个O形环密封件(9，10)。第一密封件(9)可位于盖保持器部分(2)的顶部，并且第二密封件(10)可位于盖(3)的基部。

技术领域

本发明涉及病原体检测领域。

背景技术

通常，用于筛选高防护水平病原体(如埃博拉病毒(Ebola))的存在的分子方法需要附加水平的生物安全性，以保护执行测试的操作员。筛选这些病毒性出血热的第一步是从患者那里抽取静脉血。采集样品的个体通常会穿着全面的个人防护装备，包括多副手套、防护服和口罩。采集血液样品后，通过浸泡在漂白剂以及然后杀病毒剂(例如异硫氰酸胍)中来对收集容器的外部进行消毒，以在进行核酸提取之前使病毒不具传染性。这些已知方法包含多步骤程序，并且因此需要训练有素的使用者并可以进入实验室。

用于这类测试的静脉抽取液的典型体积为3至6ml，因此，考虑到必须进行多次液体转移和取下瓶盖，暴露于病原体的风险很高。如果可以直接处理较小的体积，如较小体积的血液，则这种暴露的风险可以被降到最低；并且如果可以对进行直接分子测试的反应容器进行设计，使得其具有多种生物安全性特征，则病原体释放的风险可以被大大地降到最低。

如果要处理较小体积的样品(例如血液)，以最大程度地提高操作员的安全性，那么灵敏度的要求就会增加。世界卫生组织研发蓝图(https://www.who.int/blueprint/en/)将3,000病毒体/ml全血的水平定义为适合发展中国家进行低成本诊断的检测水平。这将有可能检测多种疾病，包括HIV和丙型肝炎，并且包括上述病毒性出血热(埃博拉病毒、拉萨热(Lassa)、马尔堡病(Marburg)、裂谷热(Rift Valley fever)、克里米亚刚果热(Crimean Congo fever)、尼帕(Nipah)、黄热病(Yellow fever)、登革热(Dengue)等)。3,000病毒体/ml的数字将提供检测下限的要求，并为直接添加到反应中所需的血液量提供指导，因为3,000/ml是每微升3个病毒靶标。

需要对当前的方法和设备进行改进，以允许更安全地检测病原体，特别是在使用安全设备受到限制的情况下，如在某些第三世界国家，这与某些最致命的病原体的高发率相吻合。

血液是通常用于诊断的潜在病原体的易于获取和常用来源。

通常经由基于PCR的诊断(包括rtPCR)检测病原体。然而，就酶促扩增过程和用于检测呈PCR的某些形式(如rtPCR)的PCR产物的存在的光学器件而言，PCR受全血的存在抑制。全血含有抑制剂，如血红素、铁、免疫球蛋白和其他抑制剂，这些抑制剂会抑制执行PCR所需的聚合酶或从RNA靶标扩增所需的逆转录酶。同样，实时过程中使用的荧光团被血液中如血红素的物质淬灭，并且血液本身具有自己的吸收光谱和发射光谱，最终结果是，在高浓度的血液的存在下，实时PCR被认为是不可靠的。灵敏度的责任(特别是在使用低体积的血液时)是指，血液必须在PCR中占总反应体积的较大百分比，并且将达到由于反应不透明，因此无法再执行实时PCR的点。

鉴于上文，使用血液样品的基于PCR的诊断通常需要多个步骤，例如去除红细胞使得血浆或血清可以进入PCR反应，提取病原体核酸，和/或提取得到的PCR产物，使得可以在不存在红细胞的情况下执行检测。这些多个步骤需要实验室设备、生物安全的环境和安全设备，以确保临床从业人员和实验室人员不会受到感染，这意味着检测并不简单，并且不适合于病原体的基于现场的快速检测。