[发明专利]一种得到高纯度异源抗体的方法

说明书

本发明属于抗体工程领域，提供了一种得到高纯度异源抗体的方法，所述异源抗体含有两条氨基酸序列不同的重链，在其中一条重链恒定区的I253引入突变，进而通过蛋白A亲和层析纯化，即可获得高纯度的双特异性抗体，其中，以上所述的氨基酸的位置根据KABAT编号的EU索引确定。本发明仅在重链引入一个突变，将重链恒定区中的EU编号第253位的Ile突变为Asn，即可只通过一步蛋白A亲和层就能将异源抗体的纯度提高到99％以上，大大简化了纯化步骤，降低制备成本，具有广阔的商业应用前景。

技术领域

本发明属于抗体工程领域，具体涉及一种得到高纯度异源抗体的方法，所述异源抗体含有两条氨基酸序列不同的重链。

背景技术

双特异性抗体有多种构建方式，其中IgG型双特异性抗体具有和普通抗体相似的结构、理化性质和Fc段功能。通常IgG型双特异性抗体由两条氨基酸序列不同的重链(即抗抗原A的重链和抗抗原B的重链)和两条氨基酸序列不同的轻链(即抗抗原A的轻链和抗抗原B的轻链)组成。当4条多肽链组合时，会产生8种不同的组合方式，其中只有一种为所需要的目标抗体分子。而从8种分子中分离纯化得到目标分子效率极低且非常困难。

作为解决该问题的方法，文献1报道了使用共同重链和两条不同轻链组合的方法。但该方法的局限性在于，要筛选得到氨基酸序列完全相同的抗抗原A的重链和抗抗原B的重链非常困难。文献2、3报道了使用共同轻链和两条不同重链组合的方法。但该方法的局限性在于，2条不同的重链会有3种组合方式，包括一种异源抗体(双特异性抗体)和两种同源抗体(杂质)，其中目标双特异性抗体的比例理论上通常只有约50％。如果提高2条重链异源缔合的效率，则可将目标双特异性抗体的表达效率提高到90-95％(文献4)。为了进一步去除两种同源抗体，文献5报道了下述方法：通过在两种重链的可变区引入氨基酸突变赋予两种同源抗体和目标双特异性抗体不同的等电点，从而通过离子交换层析纯化得到目标双特异性抗体。然而需要注意的是，在IgG型抗体商业化制备过程中，离子交换层析并非必需的纯化步骤，增加离子交换层析固然可以提高目标抗体的纯度，但也降低了最终的产率，导致制备成本增加。

蛋白A亲和层析作为IgG型抗体必需的纯化步骤，如何通过蛋白A亲和层析得到高纯度的双特异性抗体成为研究的新方向。文献6报道了一种方法：使用由小鼠IgG2a的重链(可与蛋白A结合)和大鼠IgG2b的重链(不与蛋白A结合)组成双特异性抗体，仅利用蛋白A纯化即可将目标双特异性抗体纯化至95％的纯度。但该方法的局限性在于，小鼠和大鼠的重链恒定区免疫原性极高(文献7)，而且利用该方法制备的抗体卡妥索单抗(Catumaxomab)在人体内半衰期为约2.1天，与通常的人IgG半衰期2-3周相比极短(文献8)。文献9报道了另一种利用蛋白A纯化得到高纯度的双特异性抗体的方法：在构成双特异性抗体的其中一条重链恒定区上引入突变。具体来说，将EU编号第435位的His突变为Arg，从而改变与蛋白A的结合力，能将目标抗体纯化至93-99.6％不等的纯度。

文献1：Fischer,N.,et al.(2015).Nat Commun 6:6113.

文献2：WO98050431

文献3：WO2006109592

文献4：WO2006106905

文献5：WO2007114325

文献6：WO95033844

文献7：Clin Cancer Res 2007 13:3899-3905

文献8：J Clin Oncol 26:2008(May 20suppl；abstr 14006)

文献9：WO2011078332

发明内容