[发明专利]一种针对肿瘤疫苗免疫响应检测的阳性多肽池及其制备方法

说明书

本发明公开了一种针对肿瘤疫苗免疫响应检测的阳性多肽池及其制备方法，阳性多肽池由以下多肽序列制备成的多条组合肽组成；多肽序列包括：将能够与MHC I型分子结合并被高效递呈、引起免疫应答的表位肽序列，标记为A段序列；将能够与MHC II型分子结合并被高效递呈、引起免疫应答的表位肽序列，标记为B段序列；通过Linker序列连接A段序列和B段序列成为完整的多肽序列；使用本发明制备出的阳性多肽池能够用作多肽疫苗免疫响应体外检测正对照刺激物的多肽池，使得到的通用型阳性多肽池具有与肿瘤多肽疫苗相似的刺激免疫系统产生响应的作用机理，避免产生假阴性情况，检测结果准确性高，稳定可靠。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是一种针对肿瘤疫苗免疫响应检测的阳性多肽池及其制备方法。

背景技术

2019年1月，国家癌症中心发布了最新一期统计数据，2015年我国恶性肿瘤发病约392.9万人，死亡约233.8万人。平均每天超过1万人被确诊为癌症，每分钟有7.5个人被确诊为癌症。尽管攻克肿瘤是研究人员一直以来追求的目标，但还存在着巨大的困难。其中一个重要原因是广泛存在的肿瘤异质性。不仅在肿瘤组织内部，即使是同一类型的肿瘤在不同患者间也存在着极大的差异。快速生长增殖的癌细胞往往来不及修复DNA在复制过程中产生的编码错误，从而出现新的突变蛋白，即肿瘤新生抗原(neoantigen)。随着科学家们研究的深入，在2017年发表于《Nature》杂志的两项独立研究结果表明，通过筛选预测肿瘤患者体内特异性表达的肿瘤新生抗原，设计制备得到针对每个患者的个体化肿瘤新生抗原疫苗，可以有效激活黑色素瘤中晚期复发高危患者自身免疫系统，初步实现真正的个体化肿瘤精准治疗。目前已经报道在研的新生抗原肿瘤疫苗的类型主要有多肽、RNA、DNA和免疫细胞(如树突细胞和T细胞)。因此，基于肿瘤疫苗研究的重要性，需要开发能够快速准确检测疫苗免疫响应效果的技术或产品。

在肿瘤免疫治疗中，多肽刺激的免疫细胞因子及抗体体外验证是检验多肽免疫原性的有效方法。酶联免疫斑点技术(ELISpot)是一种成熟的体外检测多肽疫苗免疫响应的技术[3]。人体免疫系统在受到刺激物的刺激后，部分刺激物能够直接被T细胞识别，产生免疫响应，另一些则需要通过APC(抗原递呈细胞)将刺激物抗原信息处理并呈递给T细胞，进而由T细胞分泌出特定细胞因子，最后通过ELISpot技术以斑点的形式表现出来，斑点的强弱和数量反映了细胞对刺激物的反应能力和分泌目的细胞因子的能力。ELISpot试验需要设置复杂的对照组，包括阳性对照、阴性对照及空白对照。目前在ELISpot实验中比较常用的阳性对照刺激物有CEF peptide pool(病毒短肽池：由若干长度为9-15个氨基酸的多肽组成)、PHA(植物凝集素)、PMA(佛波酯)和Ionomycin(离子霉素)。T细胞无法直接识别天然蛋白质抗原信息，只能识别与MHC分子形成复合物的抗原肽成分，需要其它免疫细胞的辅助。抗原递呈细胞APC能内吞蛋白质抗原，降解为多肽并表达于细胞表面形成MHC-抗原复合物，进一步由T细胞识别并产生免疫应答。以DC细胞为例，DC在未成熟阶段具有很强的吸收并消化处理长多肽的能力，但是把抗原信息递呈给T细胞的能力很弱，然而当DC发育成熟后，它形成MHC-抗原复合物并且递呈给T细胞的能力会变强。目前的阳性对照物，其中CEF可以直接和MHC结合形成MHC-抗原复合物，只需要抗原递呈细胞(APC)的递呈(不需要摄取加工)，而PHA、PMA、Ionomycin都是直接刺激T细胞，都不需要APC的参与[4]，所以这些阳性对照物并不能完全模拟蛋白质抗原经过未成熟DC到成熟DC然后递呈给T细胞的复杂过程。