[发明专利]促进精原干细胞增殖的培养方法及其应用

说明书

本发明公开了一种促进精原干细胞增殖的培养方法，其包括：培养过程中应用了细叶石斛酚A。细叶石斛酚A在细胞培养液中的终浓度为100‑300mg/L。步骤为：（1）精原干细胞的分离与纯化；（2）细胞饲养层的制备；制备Sertoli细胞饲养层；（3）诱导共培养：将分离获得的精原干细胞制备成悬液，将精原干细胞接种于Sertoli细胞饲养层上。

技术领域

本发明涉及一种促进精原干细胞增殖的培养方法及其应用，属于细胞培养技术领域。

背景技术

随着社会生活节奏及生活环境的快速变化，男性不育的比率不断增加。精原干细胞(spermatogonial stemcells，SSCs)是位于睾丸生精管基膜上具有永生化和多能化潜能的一类原始生精细胞，是精子形成的前体细胞。一方面可以不断自我更新换代，另一方面又可以分化与增殖，进而扩增为男性精子细胞形成成熟精子。所有精原干细胞均位于雄性睾丸生精上皮基膜内侧，包括多种类型，A型、B型及In型。研究认为，精原干细胞是先从A型过渡到In型，再分化至B型。精原干细胞经过有丝分裂产生初级精母细胞，再分化为次级精母细胞，最终形成成熟的精子，最终保持男性精子数量及活力。研究精原干细胞对于治疗男性无精子症具有广阔的临床应用价值。体外建立快速、有效的培养方法以获得满足临床治疗应用的精原干细胞，是进行精原干细胞移植有待解决的主要问题。

细叶石斛Dendrobium hancockii Rolfe 是兰科（Orchidaceae）石斛属Dendrobium Sw. 多年生草本植物，又名姬竹叶石斛，生于海拔700～1 500 m 的山地林中树干上或山谷岩石上，在我国主要分布于陕西秦岭以南、甘肃南部、湖北东南部、湖南东南部、广西西北部、贵州南部至西南部和云南东南部，在贵州主要分布于罗甸、望谟、册亨、安龙和兴义。石斛属植物多为传统名贵中药，含有类型多样的化学成分，除了特征性成分生物碱外，主要还有联苯类、菲类、芴酮类、黄酮类和萜类等，药理研究表明石斛属植物有多种生物活性，如增强免疫力、缓解糖尿病及其并发症、抗肿瘤、抗氧化和延缓衰老、护肝抗炎、神经系统保护作用等。

本发明旨在提供一种促进精原干细胞增殖的培养方法及其应用，在辅助生殖领域具有很大的应用潜力。

发明内容

本发明的目的是提供一种促进精原干细胞增殖的培养方法及其应用，在辅助生殖领域具有很大的应用潜力。

细叶石斛Dendrobium hancockii Rolfe 是兰科（Orchidaceae）石斛属Dendrobium Sw. 多年生草本植物，又名姬竹叶石斛，生于海拔700～1 500 m 的山地林中树干上或山谷岩石上，在我国主要分布于陕西秦岭以南、甘肃南部、湖北东南部、湖南东南部、广西西北部、贵州南部至西南部和云南东南部，在贵州主要分布于罗甸、望谟、册亨、安龙和兴义。石斛属植物多为传统名贵中药，含有类型多样的化学成分，除了特征性成分生物碱外，主要还有联苯类、菲类、芴酮类、黄酮类和萜类等，药理研究表明石斛属植物有多种生物活性，如增强免疫力、缓解糖尿病及其并发症、抗肿瘤、抗氧化和延缓衰老、护肝抗炎、神经系统保护作用等。

遵义医科大学药学院从细叶石斛中分离得到一种新的化合物细叶石斛酚A：3,α-二羟基- 4,5,3′-三甲氧基联苄，其分子式为C17H20O5，其HMBC结构如下：

。

本发明团队意外发现细叶石斛酚A可以应用于促进精原干细胞增殖，在辅助生殖医疗技术领域具有很大的应用潜力。

本发明所需要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现。

一种促进精原干细胞增殖的培养方法，其包括：

培养过程中应用了细叶石斛酚A。

作为优选，其步骤如下：

（1）精原干细胞的分离与纯化：