[发明专利]间充质干细胞来源囊泡包裹三氧化二砷的制备方法

说明书

本发明涉及一种间充质干细胞来源囊泡包裹三氧化二砷的制备方法，包括：1)将间充质干细胞置于含有三氧化二砷的培养基中，先进行紫外照射处理，后进行培养，使间充质干细胞释放囊泡，2)提取培养物中的囊泡，得到间充质干细胞来源的囊泡包裹的三氧化二砷。本发明结合紫外线照射和药物处理的方式，将ATO包入MSC‑EVs中，制备成复合制剂，以期同时发挥ATO和MSC‑EVs的免疫调节作用，对GVHD进行干预，为临床治疗提供新方法。

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及利用间充质干细胞来源囊泡(MSC-EVs)包裹三氧化二砷(ATO)制备复合制剂的方法。

背景技术

急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease,aGVHD)是异基因造血干细胞移植(allo-geneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)后一种重要的并发症，是移植后导致患者死亡的主要原因之一。糖皮质激素是目前公认的aGVHD一线治疗药物，但激素治疗维持长期缓解的患者不足50％，激素耐药aGVHD死亡率达70％以上。因此，激素耐药aGVHD成为造血干细胞移植后合并症的研究热点。近年来，MSC治疗激素耐药aGVHD有许多进展，其通过调节T细胞亚群增殖分化，阻断DC向T细胞提呈抗原、干扰NK细胞功能、以及归巢至损伤部位、促进组织修复等减轻aGVHD。

细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)是由细胞经旁分泌方式产生的纳米级微颗粒，主要包括外泌体、膜微粒和凋亡小体3种组分，其分子大小和产生方式略有差异。EVs存在于广泛微环境，包括血液、唾液、精液、尿液、乳汁等，几乎所有细胞均可自发或经刺激后产生EVs，如MSC能在低氧环境下诱导产生EVs。EVs携带众多细胞内信息物质(如细胞生长因子、mRNA、miRNA、DNA、脂质等)从而能参与物质交换、信息传递等功能。在临床应用中，EVs既能作为药物本身，也能作为药物载体发挥作用。MSC来源细胞外囊泡(MSC derivedEVs,MSC-EVs)相较于MSC，有诸多优势：首先，MSC-EVs为非细胞，无致肿瘤、致突变等安全性问题；其次，MSC-EVs定向将母细胞信息向特定靶细胞传递，同时其磷脂双分子层保护所包含的物质在信息传递过程中不受降解；最后，MSC-EVs容易制备，适合量产，便于运输。上述优势均为MSC-EVs在临床上广泛应用提供了可能。

三氧化二砷(ATO)ATO作为砒霜的主要成分之一，是祖国传统医学中的药物。近年来，ATO逐渐被发现在自身免疫病中有一定治疗作用；因为ATO既能发挥促炎作用，也能发挥抗炎作用，在不同环境调节免疫平衡。Singer M等鼠模型验证ATO可通过促进中性粒细胞凋亡，减轻结肠炎炎性反应；Bobe Pdeng研究表明ATO通过促进活化的T淋巴细胞凋亡治疗小鼠SLE；研究发现，ATO也促进CD4+T细胞、嗜酸性粒细胞等凋亡，促进Treg细胞产生，影响单核细胞和B细胞分化过程。Kavian N等采用ATO杀伤CD4+T细胞和浆细胞样树突状细胞(pDC)，缓解鼠模型慢性GVHD(Chronic GVHD，cGVHD)。

发明内容

本发明提供了一种利用MSC-EVs包裹ATO制备复合制剂的方法，用于干预GVHD，为其治疗提供新方法，提高ATO治疗GVHD的治疗效果。

间充质干细胞来源囊泡包裹三氧化二砷(MSC-ATO-EVs)的制备方法，包括如下步骤：

1)分离、传代培养间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSC)；

2)加入三氧化二砷(Arsenictrioxide,ATO)处理MSC，同时紫外线照射，使MSC释放囊泡(Extracellular vesicles,EVs)；

3)采用多次离心方法提取包括有ATO的MSC囊泡，即得到MSC-ATO-EVs。

上述方法中，所述间充质干细胞来源囊泡包裹三氧化二砷(MSC-ATO-EVs)为一种复合制剂。