[发明专利]金纳米簇在检测生物样品中蛋白质淀粉样纤维化及筛选抑制剂的应用

说明书

本发明公开了金纳米簇在检测生物样品中蛋白质淀粉样纤维化及筛选抑制剂的应用。本发明以溶菌酶为模型蛋白，研究发现，金纳米簇的荧光强度随着溶菌酶纤维浓度的增大而增强，并且在一定的浓度范围内溶菌酶纤维浓度与荧光强度呈线性关系，因此可将金纳米簇应用于生物样品中蛋白质淀粉样纤维化过程的检测。与利用传统有机染料硫黄素T(ThT)的荧光法相比，金纳米簇具有低毒性、大Stocks位移的优点，且金纳米簇的荧光信号随蛋白质纤维化的程度变化灵敏，可以更灵敏地检测蛋白质由纤维化初期到对数生长期的转变，可更有效地研究蛋白质淀粉样纤维化过程和机理，并可用于筛选蛋白质淀粉样纤维化的抑制剂。

技术领域

本发明属于蛋白淀粉样纤维化检测技术领域，具体涉及金纳米簇在检测生物样品中蛋白质淀粉样纤维化的应用，以及金纳米簇在筛选蛋白质淀粉样纤维化的抑制剂中的应用。

背景技术

阿尔兹海默症、亨廷顿症等老年疾病越来越受到人们的关注。临床研究表明，这些老年病症的一个很重要的病因是由于体内蛋白质的变性聚集，即蛋白的淀粉样纤维化。例如，当体内胰岛素变性聚集时，就会导致Ⅱ型糖尿病的发生。因此，研究蛋白质纤维化的机理和筛选蛋白质淀粉样纤维化的抑制剂在疾病的治疗和预防中都有极其重大的意义。但是，淀粉样纤维的形成机理至今仍有很大争议，先后提出了多种形成机理，其中，核依赖模型是其中比较有代表性的一种。核依赖模型认为蛋白质浓度达到一个临界值后出现滞后期，先成核，再逐渐形成结构规律的淀粉样纤维。蛋白质在滞后期，单体形成寡聚体然后聚合形成晶核；在生长期，晶核与单体蛋白进一步聚集生成了原纤维；在成熟期原纤维进一步生长，最终生成了具有β-折叠的成熟纤维。虽然这一机理被广泛接受，但是，目前仍没有确凿的证据证实这一机理。除此之外，在制定疾病预防和治疗方案时，蛋白纤维化抑制剂有着十分重要的作用。因此，建立一种全新的蛋白质淀粉样纤维化过程的检测方法，对探究这些老年性疾病的发生机制和筛选蛋白质纤维化的抑制剂十分重要。因为功能蛋白在人体中的含量极低，所以通常采用模型蛋白进行研究，例如鸡蛋清溶菌酶、牛胰岛素、β-乳球蛋白等。而鸡蛋清溶菌酶因为其价格低廉、易纤维化的特点以及与人体溶菌酶结构的相似性，最常应用于蛋白纤维化的研究。

随着科学技术的发展，检测蛋白质淀粉样纤维化的方法越来越多，其中包括硫黄素T(ThT)荧光标记检测法、ANS荧光标记检测法、圆二色光谱法、透射电子显微镜、红外光谱、紫外光谱、质谱、核磁、高效液相、散射法、原子力显微镜、偏光显微镜等等。虽然方法众多，但是这些方法都存在一些不便，例如仪器昂贵，操作步骤复杂，需要专业的操作人员，耗时长等，这将会浪费很大的人力财力物力。但是，荧光检测方法操作简便，在这一系列方法中占有很大的优势，成为了最受欢迎的检测方法之一，尤其是ThT荧光标记检测法一直沿用至今，是一种广泛应用的研究方法。但它也存在一些不足之处，例如可能会产生假阳性信号、较低的选择性和灵敏度，Stocks位移小、无法识别蛋白质的低聚体等。因此有很多工作者在荧光检测法中继续提出了一些新型的荧光探针并将其应用于蛋白质纤维化过程的检测。

随着聚集诱导发光效应和分子转子等概念的提出，聚集诱导发光现象受到了广泛的关注，聚集诱导发光分子在溶液状态下荧光很弱甚至是不发荧光的，但是当它们分散在不良溶剂中或者是在固体状态时，却会发出明显的荧光。基于这样的性质，一些研究学者开始将一些分子转子应用于蛋白质淀粉样纤维化的检测，例如4-[2-(2-萘基)(E)乙烯基)苄基三苯基溴化磷、2(四苯基磷)四苯基乙烯等等，这一类的检测方法都是基于有机小分子的聚集诱导荧光来实现的。当它们与蛋白质纤维结合之后，其荧光强度会有所增强，而且随着蛋白质孵育时间的增加，其荧光强度是在不断增强后趋于不变的，直至纤维化过程结束，但这些方法依旧是小分子类的探针，其合成方法都较为繁琐。研究表明，新型荧光探针金纳米簇也具有聚集诱导荧光增强效应，而且金纳米簇具有低毒性、高稳定性、大的Stokes位移、低能红光发射、荧光寿命长且具有良好的生物相容性等优势。

发明内容

本发明的目的是为金纳米簇提供新的应用。

金纳米簇在检测生物样品中蛋白质淀粉样纤维化的用途，具体检测方法如下：