[发明专利]铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白rePilA-FliC及制备方法和应用

说明书

本发明属于细菌性抗原技术领域，公开了一种铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白rePilA‑FliC及制备方法和应用，所述铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白rePilA‑FliC的核苷酸序列为SEQ ID NO:1；氨基酸序列为SEQ ID NO:2；重组表达载体包含核苷酸序列SEQ ID NO:1。本发明采用pGEX‑6p‑2载体来构建重组表达质粒，表达重组蛋白rePilA‑FliC，pGEX是表达融合蛋白的载体，所表达的融合蛋白中含有一个蛋白纯化的GST标签。与其他融合载体相比，pGEX系列载体具有纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而使纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性。

技术领域

本发明属于细菌性抗原技术领域，尤其涉及一种铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白rePilA-FliC及制备方法和应用。

背景技术

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)是烧伤、战创伤、机械通气患者等院内感染最常见的病原菌，可导致重症肺炎、肺功能衰竭、脓毒血症乃至死亡。WHO在2017年发布的《新抗生素研究、发现和全球抗生素耐药细菌优先性列表》中将PA列为第二，由此表明，PA感染流行导致的健康问题十分严重。由于PA对抗生素产生多重耐药或泛耐药性，临床治疗效果十分有限。数据显示，2016年PA总分离率为8.69％，特别是机械通气性肺炎中PA的分离率高达22.9％。PA对亚胺培南和美罗培南的年度耐药率已达到23.6％和20.9％。由于PA在临床上的高感染率和耐药率的不断攀升，寻找新的“非抗生素疗法”迫在眉睫。

由于抗生素的滥用等原因，PA的耐药问题逐渐突出，出现了泛耐药铜绿假单胞菌(PDR-PA)和多重耐药铜绿假单胞菌(MDR-PA)，且耐药性PA的分离率逐年上升。从免疫学角度入手，研制开发出安全有效的疫苗成为最为理想的选择，但目前还未见有上市的铜绿假单胞菌疫苗。综上所述，现有技术存在的问题是：研究疫苗的关键是寻找到免疫原性和免疫保护效果好的抗原。研发基因工程疫苗的关键是如何从成千上万的病原体蛋白质组中筛选到良好的保护性抗原分子。

铜绿假单胞菌的菌毛(pilus)由菌毛蛋白(PilA)多聚而成，位于细菌表面，参与了细菌粘附、蠕动、生物膜形成，耐药基因转移等细菌的生理和致病过程。此外，铜绿假单胞菌菌毛还可以激发宿主的疫苗反应，是潜在的候选疫苗抗原。已经有报道在小鼠创伤感染PA模型、小鼠烧伤感染PA模型和小鼠PA肺炎感染模型上观察到了菌毛蛋白PilA蛋白具有一定的免疫原性，且能发挥免疫保护效果(Bakht Azad等2018，Banadkoki AZ等2016，Korpi F,等2016)。然而PilA蛋白单独作为疫苗抗原使用时具有分子量小，免疫原性弱，均一性较差等问题。

鞭毛是广泛存在于细菌表面的一种细长、弯曲波浪状的超大分子蛋白质机器。是细菌主要的运动器官(Haiko J等2013)。PA单端有1～3根鞭毛，除了负责细菌的运动外，还作为主要的毒力因子，在细菌的粘附与定植、生物膜的形成、激活TLR5并诱导炎症反应等致病过程中发挥关键作用(Klockgether J等2017)。鞭毛是由三十多种蛋白质组成的超大分子蛋白质机器，主要包括基体部(Basal body)、鞭毛钩(Hook)和鞭毛丝(Filament)三个部分，其中由鞭毛丝蛋白(FliC)组装而成的鞭毛丝，位于鞭毛的末端，是起主要的功能结构域。FliC是免疫调控PA感染的关键靶点之一，已经研究表明靶向FliC的疫苗和抗体具有显著的免疫保护效果(SahaSukumar等2017，TanomandAsghar等2013)。然而，天然的FliC制备困难，且易聚集和降解，还需要变性复性的步骤，操作繁琐(CSobhanFaezi等2016)，难以满足疫苗抗原的应用。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白rePilA-FliC及制备方法和应用。本发明所述疫苗具有工艺简单、成本低、可操作性强等优点。

本发明的技术方案是：