[发明专利]一种维生素B12

说明书

本发明涉及生物制药技术领域，特别是涉及一种B₁₂发酵补料培养基及补料方法，提供可维持发酵中后期菌体生长繁殖并持续合成维生素B₁₂的发酵补料培养基及补料方法。通过在不同发酵阶段进不同的补料，在不同阶段将总糖、甜菜碱、溶氧量、甘氨酸控制到到最适宜的含量，平衡发酵中后期菌体生和代谢关系，充分改善菌体老化发空现象，提高发酵单位；解除底物抑制、产物反馈抑制和分解代谢物的阻遏；避免一次投料过多造成细胞大量生长所引起的一切影响，改善发酵液流变学性质。

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，特别是涉及B₁₂发酵补料培养基及补料方法。

背景技术

维生素B₁₂又叫钴胺素，是唯一含金属元素的维生素。维生素B₁₂是以脱氮假单孢菌为发酵菌株，发酵生产出来的一类维生素。维生素B₁₂主要生理功能是参与制造骨髓红细胞，防止恶性贫血；防止大脑神经受到破坏。是神经系统功能健全不可缺少的维生素。

现有技术中，以脱氮假孢菌做出发菌株发酵过程中，需要补入甜菜碱。甜菜碱能促进细胞表面分泌代谢产物以刺激细菌产生维生素B₁₂。此外，甜菜碱是维生素B12生产过程中的甲基供体，同时甜菜碱脱甲基后形成的甘氨酸作为氮源参与了菌体的生长代谢。

但是维生素B₁₂是一种初级代谢产物，它跟菌体的生长密切相关，高浓度甜菜碱会抑制菌体生长，不利于维生素B₁₂的合成。因此，在脱氮假单胞菌发酵产维生素B12的过程中，一般采用分次补加工艺，以维持甜菜碱浓度又不致过大而对菌体生长产生负面影响。这种方式在菌体生长代谢旺盛的阶段可达到较好的效果，但是在130小时后的发酵中后期阶段，随着菌体的生长代谢减弱，菌体对甜菜碱的分解代谢减弱，甘氨酸和甲基的供给也随之减弱，这又进一步影响到菌体的生长和维生素B₁₂的合成。

因此在菌体生长后期如何在保证菌体生长不受抑制的情况下，又能保证甘氨酸和甲基的供应对菌体的生长和维生素B₁₂的合成十分重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可维持发酵中后期菌体生长繁殖并持续合成维生素B₁₂的补料方法。同时平衡发酵中后期菌体生和代谢关系，充分改善菌体老化发空现象，提高发酵单位。

本发明的技术方案为一种维生素B₁₂发酵补料培养基补料方法，所述维生素B₁₂发酵补料培养基用于以脱氮假单孢菌为生产菌种发酵生产维生素B₁₂的发酵过程中，包括以下步骤：

步骤1：在发酵25-35小时，当总糖含量低于5.0％时补入补料A，所述补料A至少包括葡萄糖；

步骤2：在发酵35小时后，当甜菜碱含量低于0.5％时补入补料B，所述补料B至少包括甜菜碱；

步骤3：从步骤1开始补入补料A到发酵70小时，控制总糖含量在4％-5％，发酵70小时后控制总糖含量3.0％-4.0％至放罐；

步骤4：从步骤2开始补入补料B到发酵至130-150小时，控制甜菜碱含量在3％-5％，发酵130-150小时后不再补加甜菜碱；

步骤5：在发酵过程的前20小时，将发酵液溶氧量控制在15％-25％，在发酵过程的20小时后，将发酵液溶氧量控制在5％-15％；

步骤6：从发酵到发酵至130-150小时，补加补料C，所述补料C至少包括甘氨酸和氯化胆碱，控制甘氨酸含量在0.2-0.5％。

而且，补料A为葡萄糖300-600g/L，氯化钴0.3-0.7g/L，5-6二甲基苯并咪唑0.3-0.7g/L，消泡剂0.2-0.5g/L。