[发明专利]一种从乳杆菌中提取肽聚糖的方法

权利要求书

1.一种从瑞士乳杆菌MB2-1(Lactobacillus helveticus MB2-1)提取肽聚糖的方法，其特征是由以下步骤组成：

(1)菌体的制备

将瑞士乳杆菌活化两次，在37℃连续培养24h达到稳定期后，发酵液中的菌体于6000×g离心分离25min得到，用生理盐水离心清洗3次。

(2)菌体的裂解

获得的菌体添加在4％的SDS溶液中煮沸30min，以促使菌体裂解和胞内成分溶出。然后4℃降温5min，菌体沉淀于6000×g常温下离心25min，去除上清液后，用去离子水离心清洗至SDS痕量为止。

(3)菌体细胞壁通透性的增加

对菌体沉淀采用超声波破碎，破碎条件为240W，30min，离心去上清液后，再次对菌体沉淀用去离子水离心清洗3次。

(4)磷壁酸去除

不溶的菌体沉淀悬浮于10％的三氯乙酸(w/v)溶液中，70℃水浴放置3h后，离心去除上清液，再次对菌体沉淀用去离子水离心清洗3次。

(5)脂肪去除

用0.05mol/L的乙酸调节0.02mol/L的乙酸钠溶液使其pH值为4.6，将其与氯仿、甲醇按体积比4∶5∶10混合。使用混合液按1∶20(w∶v)的比例溶解残渣以脱脂，室温搅拌24h，8000×g于4℃离心20min，沉淀用甲醇离心清洗2次后再次用去离子水离心清洗3次，收集沉淀。

(6)蛋白质的去除

清洗后的沉淀按1∶10(w∶v)加入胰蛋白酶和碱性蛋白酶(总酶活力单位为3500U)复合酶的磷酸缓冲液(pH 7.4)中，37℃水浴振荡12h以去除蛋白。再用去离子水离心清洗5-6次去除杂质获得沉淀。将沉淀加入1％SDS煮沸10min，用去离子水离心清洗至SDS痕量为止。

(7)纯化与冻存

将沉淀装入处理好的透析袋用灭菌水透析2天(每8h换水一次)，以去除无机盐、有机溶剂等低分子杂质。最后将透析后的沉淀离心清洗，将沉淀真空冷冻干燥，得到的白色或淡黄色粉末即为提取的PGN成分。将肽聚糖冻干粉保存于蓝盖瓶，放入-20℃冰箱备用。

2.根据权利要求1所述的一种从瑞士乳杆菌MB2-1提取完整肽聚糖的方法，其获取方法为：发酵液中的菌体需经过菌体裂解、菌体细胞壁通透性的增加、磷壁酸去除、脂肪去除以及蛋白质的去除，最终获得完整肽聚糖。

3.根据权利要求2所述的一种从瑞士乳杆菌MB2-1提取完整肽聚糖的方法：对发酵液离心25min(6000×g)分离获得的菌体放置在4％的SDS溶液中煮沸30min，4℃降温5min；清洗后对菌体沉淀采用超声波破碎，破碎条件为240W，30min；不溶的菌体悬浮于10％的三氯乙酸(w/v)溶液中，70℃水浴放置3h后，离心去除上清液后；配置乙酸钠∶氯仿∶甲醇(体积比)＝4∶5∶10的溶液，使菌体沉淀和混合液按1∶20(w∶v)的比例溶解残渣以脱脂；室温搅拌24h，离心收集沉淀按1∶10(w∶v)加入胰蛋白酶和碱性蛋白酶，在37℃水浴振荡12h以去除蛋白；最后将沉淀加入1％SDS煮沸10min，离心清洗后获得完整肽聚糖。

4.根据权利要求书3所述的一种从瑞士乳杆菌MB2-1提取完整肽聚糖的方法：所述中乙酸钠的配置方法为：使用0.05mol/L的乙酸调节0.02mol/L的乙酸钠溶液pH至4.6；复合酶的磷酸缓冲液配置方法为：胰蛋白酶和碱性蛋白酶(总酶活力单位为3500U)复合酶的磷酸缓冲液pH为7.4。