[发明专利]一种慢病毒体外转染人造血干细胞的试剂盒及方法

说明书

本申请公开了一种慢病毒体外转染人造血干细胞的试剂盒及方法。本申请的试剂盒，包括细胞体外预激活培养体系和慢病毒感染培养体系；细胞体外预激活培养体系中含有浓度100‑300ng/mL的SCF、100‑300ng/mL的Flt3L、10‑500ng/mL的TPO和25‑100ng/mL的IL3；慢病毒感染培养体系中含有dmPGE2和Ploxamer407。本申请试剂盒，通过对细胞体外预激活培养体系和慢病毒感染培养体系进行优化，能稳定高效进行慢病毒感染人造血干细胞，提高病毒感染效率，降低病毒用量，降低生产成本，减轻细胞治疗产品使用者经济负担，为慢病毒体外转染人造血干细胞推广应用奠定了基础。

技术领域

本申请涉及造血干细胞移植领域，特别是涉及一种慢病毒体外转染人造血干细胞的试剂盒及方法。

背景技术

异体造血干细胞移植是治疗血液病，尤其是血液癌的一种有效的方法，然而，由于HLA配型率极低等原因，患者往往无法得到及时治疗。

临床研究数据显示，体外转基因改造后的自体造血干细胞重新回输到患者体内后，能有效发挥正常功能，治愈率极高。该技术成为一种新的有效的治疗方式，有效解决了异体造血干细胞移植存在的HLA配型率低，免疫排斥，移植物抗宿主等问题。

目前，体外转基因改造自体造血干细胞技术，即重组的慢病毒体外转染人造血干细胞，主要包括以下几个方面：(1)患者自体造血干细胞动员；(2)动员造血干细胞的体外预激活培养处理；(3)构建携带正常基因的慢病毒转染预激活后的人造血干细胞；(4)将转染后的造血干细胞回输到患者体内。

虽然该技术治疗效果较好，但是仍然存在一些不足：(1)目前，造血干细胞的体外预激活培养体系差异大，尚未有一种比较统一稳定的培养体系；(2)慢病毒感染造血干细胞的效率低。针对以上存在的问题，现有的措施是：(1)在造血干细胞的体外预激活培养时，使用GMP级别来源的基础培养基，例如Stemspan-ACF、X-VIVO、SCGM等，并向基础培养基中添加预激活因子SCF、Flt3L、TPO、IL3、IL6等替代研究级别的产品；但是，所用预激活因子的浓度较高，增加了生产成本，培养效果参差不齐。(2)在慢病毒感染人造血干细胞时，通过添加药用级别的促慢病毒感染辅剂到人造血干细胞中促进转染效率，例如PGE2、Poloxamer407、Protamine、UM171、Retronectin等；但是，现有的方案，尽管添加促慢病毒感染辅剂，其转染效率仍然偏低，难以满足使用需求。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的慢病毒体外转染人造血干细胞的试剂盒及方法。

本申请具体采用了以下技术方案：

本申请的第一方面公开了一种慢病毒体外转染人造血干细胞的试剂盒，包括用于动员造血干细胞体外预激活培养处理的细胞体外预激活培养体系，和用于慢病毒转染预激活后人造血干细胞步骤的慢病毒感染培养体系；其中，细胞体外预激活培养体系中含有浓度为100-300ng/mL的SCF、100-300ng/mL的Flt3L、10-500ng/mL的TPO和25-100ng/mL的IL3；慢病毒感染培养体系中含有dmPGE2和Ploxamer407。

需要说明的是，本申请的试剂盒通过对预激活因子的组合跟浓度进行优化，可以在不改变细胞质量的前提下，采用更低浓度剂量的预激活因子组合，有效的降低慢病毒体外转染人造血干细胞的成本；并且，通过对促病毒感染试剂的组合进行优化，提高慢病毒对预激活后的人造血干细胞的感染效率，降低病毒用量，从而降低整体成本，提高生产效益。

优选的，细胞体外预激活培养体系中含有浓度为100ng/mL的SCF、100ng/mL的Flt3L、100ng/mL的TPO和25ng/mL的IL3；慢病毒感染培养体系中含有浓度为10μmol/L的dmPGE2和100μg/mL的Ploxamer407。